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Accoppiamento della tecnica di frazionamento in campo flusso-flusso a fibra micro-tubulare porosa con spettrometria di massa electrospray per la caratterizzazione.

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Presentazione sul tema: "Accoppiamento della tecnica di frazionamento in campo flusso-flusso a fibra micro-tubulare porosa con spettrometria di massa electrospray per la caratterizzazione."— Transcript della presentazione:

1 Accoppiamento della tecnica di frazionamento in campo flusso-flusso a fibra micro-tubulare porosa con spettrometria di massa electrospray per la caratterizzazione di proteine F. Dal Piaz, A. Zattoni, D. Parisi, M. Guardigli, P. Reschiglian, A. Roda (Università di Bologna)

2 Relazione Struttura/Funzione nelle molecole proteiche

3 Condizioni Denaturanti Condizioni Pseudo-Native ES/MS e conformazione proteica A.E. Ashcroft et al (2002) J Biol Chem. 277(36):33115-26

4 ES/MS e complessi proteici M. Fändrich, et al, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A. 97(26):14151-5.

5 RP-HPLC: Altamente denaturante Gel Filtration: Difficoltà di interfacciamento Elettroforesi Capillare: Blandamente denaturante Difficoltà di interfacciamento Sistemi separativi classici e analisi on-line di proteine e complessi proteici in condizioni native Analytical Chemistry (2003) In press

6 Principio della "Field-Flow Fractionation" Spessore Campo esterno Introduzione del campione Flusso Detector Lunghezza Larghezza Flusso parabolico Spessore Campione

7 Il canale HF FlFFF 1/8 PEEK ferrule 1/8 1/8 Teflon tube cPVC / PSf HF membrane 24x0.08 ID cm 1/8 PE fitting 1/8 PE Tee V in V out V rad

8 Modo normale in HF FlFFF Meccanismo di ritenzione Browniano Modo normale in HF FlFFF Meccanismo di ritenzione Browniano v Flusso z Campo L U x rfrfrfrf V in V out V rad

9 Frazionamento di proteine in HF FlFFF Fase mobile: Ammonio acetato 50 mM ;pH7 V in =0.70 ml/min ;V rad =0.38 ml/min BSA 2% in FM ;mw 66 kDa Hrp 1% in FM ; mw40 kDa AP 1% in FM ; mw 160 kDa Fer 1% in FM ; mw 449 kDa

10 Costruzione della retta di taraturalnD vs lnM 9,510,010,511,011,512,012,513,013,5 -8,5 -9,0 -9,5 -10,0 -10,5 -11,0 AP Hb ln D ln M Y = A + b * X ParameterValueError A - 5.92967 0.30651 b-0.375130.02702 t R = 8D ln V out V in D= kT 3 d r f 2 D=A M -b BSA Hrp Mio Fer

11 HF FlFFF-ES/Q-TOF MS Fase mobile Scarico Valvola a 4 vie Valvola a T 0 1 2 3 Scarico Valvola diniezione Valvola a spillo Fase mobile 0.7 5 0.50 Pompa 1 0.7 5 0.50 Pompa 2 Fibra Manometro 0 1 2 3 UV-DAD ES/Q-TOF Valvola a spillo Valvola di splitting

12 Canale HF FlFFF Valvola di splitting Sorgente ES UV/vis DAD

13 +55 +50 +45 +40 +36 +60 66397.8 Peso Molecolare misurato:66397.81±1.74 Da Peso Molecolare teorico: 66398.61 Da Analisi HF-FlFFF-MS della BSA Fase mobile: Ammonio Acetato50mM ;pH7

14 0246 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 024681012 0 10 20 30 40 50 60 70 80 TIC tempo (min) segnaleUV@280 nm(mAU) Analisi HF-FlFFF-MS della HRP Fase mobile: Ammonio Acetato50mM ;pH7 A 41521.5 B 41600.4 C 42343.1 D 42422.0 E 43165.0 F 43244.1

15 C 42343.1 D 42422.0 E 43165.0 F 43244.1 Glicosilazione A 41521.5 B 41600.4 2 Ca 2+

16 Fase mobile:ammonio acetato 50mM ;pH7 Analisi HF-FlFFF-MS della mioglobina da cavallo +9+8 +7 +6 17566.70 P. M. Mioglobina:16951.51 Da P. M. Eme:615.35 Da P. M. Misurato:17566.69±0.58 Da

17 B11 B10 B9 B8 B7 A10 A9 A8 A7 A:17566.69±0.58 Da B:16951.48±0.27 Da HF-FlFFF-MS LC-MS

18 +9 +Na + +2Na + +3Na + +CH 3 COO - Introduzione Diretta HF-FlFFF Confronto spettri ES/MS del complesso Mioglobina/Eme

19 A 15125.9 B 15740.6 P.M. teorico Hb- : 15126.23 Da P.M. teorico Hb- : 15867.19 Da Eme Analisi HF-FlFFF-MS dellemoglobina umana Fase mobile: Ammonio Acetato50mM ;pH7

20 Conclusioni Laccoppiamento HF-FIFFF/spettrometria di massa costituisce un sistema semplice e robusto per lanalisi di proteine e complessi proteici in condizioni native: 1) Linterfacciamento non presenta problemi rilevanti. 2) Lassenza di interazione con una fase stazionaria e la possibilità di utilizzare qualsiasi tipo di solvente garantiscono il mantenimento della stabilita delle proteine e dei complessi in esame. Prospettive a) Miniaturizzazione del sistema separativo per interfacciamento diretto con sorgente nanospray b) Valutazione dellefficienza nellanalisi di miscele più o meno complesse c) Possibilità di utilizzo dellHF-FlFFF allinterno di un sistema cromatografico multidimensionale accoppiato con uno spettrometro di massa, per sudi nel campo della proteomica.

21 Ringraziamenti

22 Efficenza in HF FlFFF van Bruijnsvoort, M.; Kok, W.Th; Tijssen, R. Anal Chem 2001, 73, 4736

23 +8 +7 +9 Peso Molecolare misurato:14305.06±1.05 Da 14305.1 Spettro ES/MS del lisozima separato in FFF dalla BSA

24 Peso Molecolare misurato:66399.53±4.38 Da 66399.53 Liso+8 Liso+7 +40 +35 +30 +27 +43 Spettro ES/MS della BSA separata in FFF dal lisozima


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