Tecniche analitiche Nozioni teoriche fondamentali sulle quali sono basate le tecniche Descrizione della strumentazione Applicazioni delle tecniche esaminate.

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1 Tecniche analitiche Nozioni teoriche fondamentali sulle quali sono basate le tecniche Descrizione della strumentazione Applicazioni delle tecniche esaminate Limiti e vantaggi Nella presente lezione verranno prese in considerazione le tecniche analitiche di uso nei laboratori clinici 1

2 Tecniche analitiche - basate su interazioni energia radiante –materia
- tecniche elettrochimiche (elettroforesi, elettrofocalizzazione) Tecniche immunochimiche ( antigene-anticorpo, marcatori)

3 Tecniche basate su interazione energia radiante-materia
SPETTROMETRIA TORBINOMETRIA NEFELOMETRIA FLUORIMETRIA LUMINESCENZA

4 Corpuscolare ( fasci di fotoni) onda elettromognetica
Energia radiante Corpuscolare ( fasci di fotoni) onda elettromognetica

5 Energia radiante E= v h , l = c/v
h = costante di Planck 6, erg v= frequenza di oscillazioni x sec. c= velocità della luce cm/sec l = lunghezza d’onda in A= 10-8 cm oppure in nm ( 1 nm= 10-9m)

6 Interazione energia radiante -materia
L’energia di un corpo non può variare con continuità , ma un corpo può acquistare energia solo in maniera discontinua attraverso l’acquisto o la cessione di “ quanti” di energia Le transizioni dallo stato fondamentale a quello eccitato e viceversa producono spettri diversi

7 Spettro di assorbimento e di emissione
Se gli e di un composto passano dallo stato fondamentale a quello eccitato assorbendo un quanto di energia ( spettro di assorbimento) Se gli e cedono un quanto di energia x ritornare nello stato fondamentale ( spettro di emissione)

8 Misura dell’energia radiante
Se Energia luminosa emessa da una sorgente radiante e parzialmente viene assorbita dalla materia a livello atomico (spettrometria atomica), a livello molecolare (spettrometria di assorbimento nel VISIBILE E UV), materia in fine sospensione in un fluido (torbinometria) La maggior parte dei metodi clinici si basano sull’interazione della materia con l’energia radiante. Le misure si riferiscono a radiazioni… 8

9 Perché sono importanti le Proprietà spettrali
Ogni classe di molecole a seconda dei legami che la compongono e della sua massa atomica assorbe a lunghezze d’onda specifiche. Proprietà spettrali di una molecola sono la firma della molecola stessa. Proprietà spettrali servono per un’analisi qualitativa ( x distinguere i composti tra di loro) e quantitativa

10 Uso della spettrometria
Determinazione della concentrazione delle proteine Determinazione dell’attività enzimatica Determinazione di costanti cinetiche

11 Determinazione della concentrazione delle proteine
Misura nell’UV Misura nel Visibile mediante metodi colorimetrici

12 Legge di Lambert -Beer A = log10 (I0/I) = e c l
e coefficiente di estinzione (dipende da l) c concentrazione l cammino ottico Cammino ottico

13 Spettrofotometro Sorgente luminosa ( lampade deuterio x UV, tungsteno nel VIS) Monocromatore ( prisma a quarzo) Celle di lettura ( cuvette) Fotorivelatore ( trasforma l’energia trasmessa in energia elettrica) Sistema di misura e registrazione

14 Determinazione concentrazione proteica nell’UV ad una l fissa
Preparazione di una soluzione di proteina a concentrazione nota ( riferimento Assorbimento della proteina di riferimento a concentrazione nota o della quale è noto e e di quella a concentrazione incognita ad una l di 280nm Proporzione Ar: Cr= Ap: Cp

15 Determinazione concentrazione proteica in un intervallo di l - Spettri d’assorbimento
Misurare l’assorbimento di un composto in un range di lunghezze d’onda 220nm a 320nm Considera il massimo di assorbimento Determinare la concentrazione di proteine e acidi nucleici, riferendosi ad una soluzione a concentrazione nota o della quale è noto e

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17 e%l Quando non è noto e e1%280 = 0,4OD
Una soluzione di riferimento 1% ( 1g/100ml) assorbe 0,4OD Proporzione x determinare la concentrazione di una soluzione a concentrazione incognita

18 Metodi colorimetrici Miscele proteiche reagiscono con reattivi e si sviluppa un colore L’intensità del colore è direttamente proporzionale alla concentrazione La misura dell’assorbanza viene effettuata dopo un tempo prestabilito, x essere sicuri che la reazione è completata Utilizzo di una soluzione proteica a concentrazione nota per costruire una retta standard Assorbimento nel VIS

19 Composizione chimica e colore
Il colore di un composto chimico dipende da: Cromofori: gruppi chimici con legami insaturi, cioè caratterizzati da elettroni insaturi

20 CURVA STANDARD di BSA e calcolo della concentrazione di una soluzione proteica ad una l fissa
BSA= 1mg/ml Pendenza retta = 0,04 A della soluzione incognita è 0,5 OD Calcola la sua concentrazione?

21 Biureto In soluzione alcalina sostanze
contenenti almeno due legami peptidici formano complessi blu-porpora (540 nm) con il rame • Metodo selettivo, poco sensibile (ottimo per campioni ad alta concentrazione: proteine del siero, negli alimenti)

22 Metodo di Lowry Il rame in cond. alcaline si complessa alle proteine•
Il reattivo di Folin reagisce con gruppi fenolici (tirosine) Sensibile; colorazione blue, Assorbimento a 770nm

23 BCA ASSAY KIT E’ un kit che contiene 2 soluzioni, Reagente A e B, che vanno mescolati prima dell’uso in un rapporto1:50 Si può utilizzare una piastra a 96 pz, si aggiungono 200 ml diBCA mix, ed generalmente 1 ml di estratto proteico. Si incuba 30 min a 37° e si effettua una lettura a 562 nm

24 Metodo di Bradford o Biorad
Comassie forma forti complessi non covalenti con le proteine tramite legami elettrostatici con i gruppi amminici e carbossilici e tramite forze di Va der Waals assorbimento a 595nm ( blue)

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26 Metodi spettrofotometrici x dosare l’attività enzimatica

27 Che informazione otteniamo dalla cinetica enzimatica
Enzima monomerico Enzima è allosterico

28 EFFETTO [S] Reazione catalizzata Reazione non catalizzata

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30 Inibizione competitiva

31 inibizione non competitiva

32 INIBIZIONE IRREVERSIBILE
Sono inibitori che si legano o che distruggono il gruppo funzionale dell’enzima che è indispensabile per la sua attività catalitica, o che si legano con un legame non covalente particolarmente stabile.

33 Cinetica x Studio del pH e T ottimale

34 Cinetica di ENZIMI REGOLATORI

35 Cinetica sigmoidea

36 Dosaggio enzimatico Scomparsa di S Comparsa di P
T e pH ottimali ( miscela di reazione) Metodi di cinetica continui Metodi di cinetica a tempi fissi

37 Cinetica continua e a tempo fisso
Cinetica continua: Si misurano le variazioni di assorbanza per tutto il tempo che si ritiene opportuno Cinetica a tempi fissi: a tempi prestabiliti si prelevano aliquote dalla miscela di reazione x misurare l’assorbanza

38 Condizioni x misurare l’attività enzimatica?
1: S e P devono assorbire a diverse l Valida la legge di Lambert-Beer Concentrazione di S saturante Controllo ( reazione in assenza di E o di S)

39 Dosaggi enzimatici spettrofotometrici
Molti S e P assorbono nel VIS o nell’UV Molti dosaggi si basano su: Interconversione di NAD(P)/ NAD(P)H, catalizzate da deidrogenasi (reazioni di ossido-riduzione) Sia la forma ridotta che ossidata assorbono a 260nm, solo la ridotta a 340nm

40 Calcolo delle unità enzimatiche
U= DE340nm x a x e x a= volume totale della miscela di saggio X = volume del campione presente nella miscela di saggio

41 Analisi enzimatica nella diagnostica clinica
Contribuisce ad una diagnosi di malattie che hanno sintomi simili Variazione di espressione e/o di attività degli enzimi o proteine

42 Enzimi più saggiati in biochimica clinica
Glutammato ossalacetato transaminasi ( GOT) Creatina fosfochinasi (CPK) Lattato deidrogenasi (LDH) Fosfatasi alcalina (AP)

43 Diagnosi Infarto dl miocardio: elevati livelli di GOT,CPH, LDH
Embolia polmonare: elevati livelli di LDH

44 Determinazione dell’attività enzimatica mediante saggi accoppiati
Reazioni accoppiate: se la reazione non produce un composto colorato si accoppia con una reazione che produce un composto colorato

45 Saggi accoppiati A( non colorato)+ B( non colorato) C ( colorato)
la quantità di C è equivalente alla quantità di A

46 Saggi accoppiati con enzimi che richiedono nucleoitidi piridinici
( NAD, NADH, NADP, NADPH): coinvolti in reazioni di ossido riduzioni RH2 + NAD R+ NADH + H+ La concentrazione di RH2 può essere misurata mediante spettro di assorbanza di NADH

47 Dosaggio spettrofotometrico del NADH
La riduzione del NAD+ a NADH determina un aumento dell’assorbimento a 340 nm, viceversa il consumo di NADH determina una diminuzione dell’assorbimento a 340 nm: queste misure di assorbimento si fanno allo spettrofotometro. Anche una reazione non deidrogenasica può essere seguita allo spettrofotometro, se viene accoppiata ad una deidrogenasica (NAD-dip), tramite un intermedio comune: A + B  C + D C + NAD+  F + NADH

48 Torbinometria Misura la luce assorbita da parte di un sistema eterogeneo (precipitato disperso in un mezzo liquido). C e A ssorbanza della sostanza in sospensione seguono la legge di Lambert-Beer Massima sensibilità è UV, ma… Sul plasma l’assobimento avviene a 500nm x evitare interferenze dell’emoglobina e bilirubina

49 Difficoltà Preparazione di sospensioni stabili e riproducibili
Difficile standardizzare le Dimensioni delle particelle

50 Nefelometria I= K NV2 I0 r2 l4
determinazione di fasi disperse molto fini Si misura la luce diffusa, con nefelometri L’intensità della luce diffusa è proporzionale alla concentrazione della fase dispersa I= K NV2 I0 r2 l4 I= KN quando V I0 l e r definite, I proporzionale a N I= intensità della luce diffusa I0= intensità della luce incidente N= numero di particelle disperse V= volume delle particelle r= distanza del fotomoltiplicatore dalla cuvetta K= costante

51 Applicazioni Proteine del plasma, lipoproteine, proteine urinarie,

52 Spettroscopia di riflettanza differenze con la spettroscopia di assorbimento
Spettroscopia di assorbimento x misura: di composti colorati naturalmente o composti suscettibili di sviluppare colore in soluzioni Linearità tra assorbanza e concentrazione Spettroscopia di riflettanza x misura: di composti che diventano colorati ma non in soluzione, ma la reazione di colorazione avviene su un supporto

53 Come e dove avviene la reazione di colorazione?
voglio dosare un composto presente nel plasma o urine Pongo il plasma su un supporto (cellulosa, , film di materiale plastico) Sul supporto ci sono zone precise “ zone reattive” impregnate di una sostanza in grado di reagire con l’analita da dosare e sviluppare colore Intensità del colore prodotto è direttamente proporzionale alla concentrazione dell’analita Strumenti misurano luce riflessa dalla macchia colorata

54 Fluorimetria Metodo ottico x analisi qualitativa e quantitativa di sostanze fluorescenti Sostanze fluorescenti sono capaci di assorbire radiazione ad una certa l ( luce eccitante) e di riemettere le radiazioni a l maggiore (luce fluorescente)

55 Sostanze fluorescenti
Sostanze con doppi legami coniugati, Sostituenti chimici –OH, -NH2, -NHR Assorbono fra 250 e nm ( spettro di eccitazione) Riemettono a l superiore ( spettro di emissione)

56 Relazione tra intensità di fluorescenza e C
F= I0 abco F= intensità della luce fluorescente I0= intensità luce eccitante a= coefficiente di assorbanza molare b= cammino ottico dipende dalla cella di misura c= concentrazione della sostanza che fluorescente o = efficienza quantica ( da 0a 1) Per soluzioni sufficientemente diluite l’intensità di fluorescenza è direttamente proporzionale alla concentrazione della sostanza fluorescente

57 Fluorimetri Sono uguali agli spettrofotometri però il fotorivelatore è posto a 90° rispetto all’asse della sorgente luminosa, in modo che il fluorimetro venga colpito solo dalle radiazioni emesse dal campione fluorescente.

58 Sensibilità e specificità dei fluorimetri
volte più sensibili dei metodi fotometrici Specificità è paragonabile Curva standard

59 Applicazione Diretta : sostanza da dosare è autofluorescente in condizioni adatte (porfirine, barbiturici) Indiretta : sostanza da dosare non è autofluorescete ma lo diventa reagendo con determinati reagenti ( reazioni di ossidazione)

60 Applicazione Dosaggio cortisolo, estrogeni, catecolamine, tiamina, calcio

61 Luminescenza Emissione di luce nel visibile da parte di una molecola quando gli elettroni passano dallo stato eccitato a quello fondamentale. se lo stato eccitato viene prodotto da una reazione chimica (Chemiluminescenza) se viene prodotto da una reazione catalizzata enzimaticamente(luciferasi) (Bioluminescenza)

62 Chemiluminescenza Esempio: dosaggio di perossido a 430nm
Composto CLridotto + H2O composto CL ossidato+ fotone catalizzatore CL: sostanza adatta x chemiluminescenza : luminolo, isoluminolo, lucigenina

63 Applicazioni della chemiluminescenza
Determinazione di attività enzimatiche ( ossidasi specifiche) Determinazione di substrati ( glucosio, acido urico, colesterolo)

64 Bioluminescenza Metodo ad alta sensibilità
Reazione x dosare ATP o enzimi ATP dipendenti: luciferasi catalizza l’ossidazione della luciferina in presenza di ATP Luciferina + ATP+ O ossiluciferina+ AMP+PP+ fotone luciferasi Luciferasi estratto dalla lucciola X dosare enzimi in reazioni accoppiate

65 Esempio: dosaggio della malico deidrogenasi
Malato+ NAD ossalacetato + NADH + H+ ossidoreduttasi NADH + H+ + FMN FMNH2 + NAD luciferasi FMNH2 + RCHO +O FMN +RCOOH + H2O +luce aldeide alifatica Luciferasi utilizza FMNH2 e O2 x ossidare aldeidi alifatica FMN che si produce è accoppiato al NADH e così viene dosato la malico deidrogenasi

66 Applicazione della bioluminescenza
1) misura di ATP Attività ATP dipendenti ( ATP-asi, esochinasi, piruvatochinasi) Substrati di queste attività ( ADP, glucosio, fosfoenolpiruvato) Sensibilità moli/campione