Cinetica enzimatica A.

Presentazione sul tema: "Cinetica enzimatica A."— Transcript della presentazione:

1 Cinetica enzimatica A

2 Specificità degli enzimi
Stereochimica Assoluta Di gruppo Di legame V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

3 Specificità degli enzimi
Specificità stereochimica V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

4 Specificità degli enzimi
Specificità assoluta V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

5 Specificità degli enzimi
Specificità di gruppo Proteasi …-Leu-Arg-Gly-Phe-… Taglia qui V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

6 Specificità degli enzimi
Specificità di legame Esterasi Estere  Acido + Alcool V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

7 Classificazione degli enzimi
Singolo enzima Ureasi Complesso enzimatico Complesso piruvato deidrogenasi V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

8 Classificazione gerarchica degli enzimi
Ogni enzima viene classificato a secondo della reazione che catalizza. Viene classificato con un numero: EC X.Y.Z.T X = classe Y = sottoclasse Z = sotto-sottoclasse T = numero dell’enzima nella sotto-sottoclasse V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

9 Classificazione gerarchica degli enzimi
1. Ossidoreduttasi Catalizzano una reazione redox. 2. Transferasi Catalizzano il trasferimento di un gruppo da una molecola ad un’altra: X-Y + Z  X-Z + Y le chinasi trasferiscono un gruppo fosfato. 3. Idrolasi Catalizzano la scissione idrolitica di legami C=O, C-N, C-C, P-O-P,… V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

10 Classificazione gerarchica degli enzimi
4. Liasi Catalizzano scissioni di legami con meccanismi diversi dalle Ossidoreduttasi e dalle Idrolasi. 5. Isomerasi Catalizzano modificazioni geometriche. 6. Ligasi (Sintetasi) Catalizzano l’unione di due molecole accoppiata al consumo di ATP o di un altro nucleotide trifosfato. V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

11 Classificazione degli enzimi
1) Ossido-riduttasi 2) Transferasi V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica 11

12 Classificazione degli enzimi
3) Idrolasi 4) Liasi V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica 12

13 Classificazione degli enzimi
5) Isomerasi 6) Ligasi V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica 13

14 Classificazione gerarchica degli enzimi
Per esempio: Alcool + NAD+  Aldeide o chetone + NADH Nome comune: alcool deidrogenasi Nome sistematico: alcool:NAD+ ossidoreduttasi EC Numero dell’enzima nella sotto-sottoclasse La sotto-sottoclasse – con NAD+ o NADP+ come accettori La sottoclasse – Agiscono sul gruppo di donatori CH-OH La classe - Ossidoreduttasi V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

15 Isoenzimi Questa classificazione NON riguarda gli enzimi in quanto proteine ma in quanto CATALIZZATORI La classificazione riguarda quindi gli enziomi che catalizzano una reazione. Proteine diverse (con diversa struttura primaria) che catalizzano la stessa reazione, sono ISOENZIMI V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

16 Isoenzimi Sono le forme multiple dovute a differenze, determinate geneticamente, di struttura primaria Sono anche isoenzimi quelle proteine che svolgono la stessa funzione ma sono geneticamente indipendenti, per esempio: EC malato deidrogenasi Citosolica (codificata dal DNA nucleare) Mitocondriale (codificata dal DNA mitocondriale) V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

17 Spontaneità Una qualunque reazione chimica avviene spontaneamente se e solo se la variazione di energia libera (G) è negativa: GT,p < 0 GT = H – TS A T e p costanti V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

18 Gfinale < Giniziale
Spontaneità Quindi, data una qualunque reazione chimica A  B Essa avviene spontaneamente se le energie libere molari GB < GA Più in generale qualunque trasformazione avviene se e solo se: Gfinale < Giniziale V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

19 Spontaneità ed equilibrio
Quando GB = GA Quindi G = 0 La reazione è all’equilibrio V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

20 Spontaneità e realtà ATP + H2O  ADP + Pi
Questo non significa che una reazione chimica (un processo) esoergonica (G < 0) avvenga con velocità apprezzabile. G°’ = -7.3 kcal·mole-1 (-30.6 kJ·mole-1) a pH 7 G° = -10 kcal·mole-1 (-42 kJ·mole-1) a pH 9 ATP + H2O  ADP + Pi V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

21 Energia di attivazione
In soluzione l’ATP è stabile perché esiste l’energia di attivazione. V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

22 Catalisi In assenza di catalizzatore: A + B  C + D
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23 Catalisi V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

24 Catalisi In presenza di catalizzatore: A + K  AK AK + B  ABK
ABK  C + D + K V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

25 Catalisi V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

26 Controllo termodinamica e controllo cinetico di una reazione
Ogni reazione può avvenire se e solo se è termodinamicamente favorita (G < 0), Avviene se e solo se vi è abbastanza energia per superare l’energia di attivazione: H202  H2O + ½ O2 Catalizzatore : Nessuno H* = 18 kcal·mole-1 Platino H* = 11.7 kcal·mole-1 Catalasi H* = 5.5 kcal·mole-1 (H* = energia di attivazione) V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

27 Cinetica chimica 27 Velocità di reazione Cinetica chimica
Dalle caratteristiche termodinamiche dei reagenti e dei prodotti si può prevedere se una reazione chimica sia realizzabíle e fino a qual punto ( in altre parole se avvenga spontaneamente e quale sia il punto di equilibrio); ma da queste non si può ottenere alcuna informazione circa la sua velocità e il suo meccanismo. Queste informazioni ci vengono dalle misurazioni cinetiche il cui obiettivo è proprio quello di determinare come e con quale velocità le molecole reagiscono tra loro. La disciplina che studia la velocità e il meccanismo delle reazioni chimiche è la cinetica chimica. Velocità di reazione. Consideriamo una generica reazione Questa equazione ci dice che A reagisce con B, dando origine a P e Q. In che modo ci accorgiamo che la reazione "parte e va avanti"? Bisogna dare per scontato che siamo in grado di determinare in qualche modo le quantità di tutti i partecipanti A, B, C e D,in qualsiasi momento: non è spesso molto facile ma qui, per semplicità, lo dobbiamo immaginar e sempre possibile. Ebbene, il fenomeno che all'esterno ci avvisa che le cose cambiano all'interno della soluzione è che le concentrazioni di A e B diminuiscono mentre quelle quelle di P e Q aumentano. Esprimiamo perciò la velocità di un processo chimico in un certo periodo di tempo tramite il rapporto tra la variazione di concentrazione di un reagente o di un prodotto ed il valore di quell' intervallo di tempo. L' espressione matematica della velocità di reazione è la seguente: dove il segno - indica la variazione negativa della concentrazione dei reagenti. D' altra parte, la velocità di reazione risulta correlata alla concentrazione dei reagenti attraverso l' equazione di velocità: dove k è la costante di velocità ed indica la misura della velocità di reazione quando i reagenti sono in concentrazione unitaria, mentre m ed n sono coefficienti che possono essere pari a zero, numeri interi o frazionari, il cui valore può essere determinato solo sperimentalmente. Ogni coefficiente determina l' ordine di reazione, rispetto al proprio componente, mentre la somma m+n determina l'ordine globale della reazione ,da non confondersi con la molecolarità che rappresenta il numero delle molecole effettivamente coinvolte nella reazione e che urtandosi in modo efficace si trasformano nei prodotti finali. k è la costante di velocità m ed n sono coefficienti che possono essere pari a zero, numeri interi o frazionari, il cui valore può essere determinato solo sperimentalmente Ogni coefficiente determina l' ordine di reazione, rispetto al proprio componente la somma m+n determina l'ordine globale della reazione V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

28 ordine globale di reazione
Cinetica chimica 2 1 legge cinetica ordine globale di reazione n m Per calcolare l' ordine globale della reazione si procede nel seguente modo: in una reazione in cui A e B siano gli unici partecipanti, si determina dapprima la velocità di reazione facendo variare A e tenendo fissa la concentrazione di B, e successivamente la velocità di reazione tenedo fisso A e variando la concentrazione di B. Se il risultato sperimentale è quello rappresentato nella figura sottostante, ovvero la velocità di reazione è direttamente proporzionale a [A]2 e a [B], allora la reazione è di secondo ordine rispetto ad A e di primo ordine rispetto a B. V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

29 Cinetica chimica 29 Qual’ è l’ordine globale di reazione?
Se sperimentalmente si trova che la velocità di reazione è direttamente proporzionale a [A]2 e a [B] Per calcolare l' ordine globale della reazione si procede nel seguente modo: in una reazione in cui A e B siano gli unici partecipanti, si determina dapprima la velocità di reazione facendo variare A e tenendo fissa la concentrazione di B, e successivamente la velocità di reazione tenedo fisso A e variando la concentrazione di B. Se il risultato sperimentale è quello rappresentato nella figura sottostante, ovvero la velocità di reazione è direttamente proporzionale a [A]2 e a [B], allora la reazione è di secondo ordine rispetto ad A e di primo ordine rispetto a B. La reazione è globalmente di terzo ordine e l' equazione di velocità totale è: v=k [A]2 [B] allora la reazione è di 2° ordine rispetto ad A e di 1° ordine rispetto a B La reazione è globalmente di 3° ordine V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

30 Fattori che influenzano la velocità di reazione
Temperatura pH Concentrazione dell’enzima Concentrazione del substrato Nel caso di enzimi allosterici anche la presenza di modulatori positivi e negativi V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

31 Temperatura V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

32 pH V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

33 [E] V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

34 [S] Se mettiamo in grafico V in funzione di [S], troviamo che:
A bassi valori di [S], la velocità V, aumenta quasi linearmente con l’aumentare di [S]. Ma come [S] aumenta, gli aumenti di V diventano via via più piccoli (iperbole rettangolare). L’asintoto rappresenta la velocità massima della reazione,Vmax La concentrazione di substrato che produce una V che è la metà di Vmax è detta costante di Michaelis-Menten, Km. V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

35 V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

36 Grafico di Michaelis-Menten
V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

37 Cinetica enzimatica 1 1913: Michaelis e Menten
La prima equazione generale di velocità per una reazione enzimatica fu derivata nel 1903 da Victor Henri. L'equazione di Henri era in grado di spiegare l' osservazione che la velocità iniziale della reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione dell'enzima, ma cresce in modo non lineare al crescere della concentrazione del substrato fino ad un valore limite massimo. Gli studi di Henri furono ripresi ed ampliati da Michaelis e Menten (1913) che hanno dato il nome alla equazione generale di velocità di reazioni enzimatiche ad un substrato. La prima assunzione su cui si basa il loro approccio cinetico (assunzione nota come del "quasi equilibrio" o dell"equilibrio rapido") è che il complesso enzima-substrato sia in equilibrio con l'enzima libero e substrato e che questa situazione di equilibrio non sia disturbata dalla formazione del prodotto. In altre parole la velocità di formazione del prodotto a partire da ES è molto piccola rispetto alla velocità con cui ES si scinde a dare E+S ( k3 <<k2 ). V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

38 In una reazione chimica
A  B v = k · [A] V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

39 In una reazione enzimatica
V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

40 E + S  ES [E]>>[S]
Enzima e substrato In una reazione tra enzima (E) e substrato (S), possiamo distinguere tre fasi: Legame tra E e S per formare il complesso ES E + S  ES [E]>>[S] Stato prestazionario Stato stazionario Scompare il substrato, [ES] diminuisce, v diminuisce V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

41 Enzima e substrato [S] [P] Concentrazione [ES] [E] Tempo 1a fase Stato
Pre-stazionario 2a fase Stato stazionario 3a fase Fine [S] [P] d[P]/dt  cost. Concentrazione [ES] D[ES]/Dt ≈ 0 [E] Tempo V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

42 Enzima e substrato [S] [P] Concentrazione [ES] [E] Tempo 1a fase Stato
Pre-stazionario 2a fase Stato stazionario 3a fase Fine [S] [P] d[P]/dt  cost. Concentrazione [ES] D[ES]/Dt ≈ 0 [E] Tempo V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

43 Enzima e substrato In una reazione enzimatica l’ordine di reazione è variabile V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

44 Enzima e substrato In una reazione enzimatica l’ordine di reazione è variabile Ordine 1 Ordine 0 Velocità Velocità [S] [S] V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

45 Trattamento secondo Michaelis e Menten
In una reazione enzimatica: Per l’equilibrio veloce (1) INDETERMINABILE INDETERMINABILE k2<<k-1 V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

46 V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

47 Trattamento secondo Michaelis e Menten
Per l’equilibrio veloce (1) [Etot] misurabile [Etot] = [E] + [ES] INDETERMINABILE V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

48 Trattamento secondo Michaelis e Menten
Da cui Costante di dissociazione del complesso ES Costante di Michaelis e Menten V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

49 Trattamento secondo Michaelis e Menten
La concentrazione del complesso ES Poiché: vdiretta = k2[ES] V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

50 Trattamento secondo Michaelis e Menten
Quando tutto Etot diventa ES allora la velocità sarà massima. Vmax = k2[Etot] Quando il substrato satura l’enzima allora la velocità sarà massima V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

51 Equazione di Michaelis e Menten
V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

52 Michaelis e Menten Leonor Michaelis (1875-1949)
Maud Menten ( ) V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

53 Trattamento secondo Michaelis e Menten
Bassa concentrazione (relativamente) di substrato: [S]<<KM (Ordine 1) Alta concentrazione di substrato: [S]>>KM (Ordine 0) V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

54 Trattamento secondo Briggs-Haldane
Da un punto di vista formale il trattamento è lo stesso di M.M., cambia il significato cinetico di KM Allo stato stazionario: V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

55 Significato di KM KM descrive l’interazione substrato-enzima a livello del sito di legame. KM è, dimensionalmente, una concentrazione: È la concentrazione di substrato al quale la velocità della reazione è metà della Vmax V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

56 Significato di Vmax Vmax è legata a k2 Vmax = k2[Etot]
Dipende dalla concentrazione dell’enzima (induzione). V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

57 Vmax/[Etot] = k2 (moli·l-1·s-1)/(moli·l-1)
Significato di k2 k2 è una frequenza Vmax/[Etot] = k2 (moli·l-1·s-1)/(moli·l-1) k2 = s-1 Numero di eventi per unità di tempo (numero di turnover). Proprietà cinetica dell’enzima. V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

58 Efficienza catalitica o numero di turnover
k2 è detta anche kcat e si ottiene: k2 è detto anche numero di turnover (Moli di substrato consumate per secondo per moli di enzima) si esprime in s-1. ~1 s-1 < k2 < 106 s-1 V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

59 Significato di KM e Vmax
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60 Enzima Sorgente Substrato Km (mM) n° di turnover (1/s) Acetil-CoA sintasi Cuore di bue Acetato 1.400 ATP-asi Muscolo di coniglio ATP 0.014 Alcool deidrogenasi Fegato di cavallo Etanolo 0.500 Anidrasi carbonica Eritrociti Anidride carbonica 7.500 Aspartato aminotransferasi Cuore di maiale Acido aspartico 0.900 Acido a-chetoglutarico 0.100 Acido ossalacetico 0.040 acido glutammico 4.000 Butirril-CoA deidrogenasi Fegato di bue Butirril-CoA Chimotripsina Pancreas bovino N-benziltirosinamide 2.500 N-formiltirosinamide 12.000 N-acetiltirosinamide 32.000 gliciltirosinamide Creatina fosfochinasi Creatina 19.000 Esochinasi Lievito Glucosio 0.150 Cervello 0.008 Fosfatasi acida Prostata a-glicerofosfato 3.000 Fosfogliceraldeide deidrogenasi Gliceraldeide-3-fosfato 0.050 Glutamato deidrogenasi Fegato bovino Acido glutammico 0.120 2.000 Ione ammonio 57.000 NAD+ 0.025 NADH 0.018 Xantina ossidasi Latte Xantina 0.030 Acetaldeide V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

61 Enzima Sorgente Substrato Km (mM) n° di turnover (1/s) Acetil-CoA sintasi Cuore di bue Acetato 1.400 ATP-asi Muscolo di coniglio ATP 0.014 Alcool deidrogenasi Fegato di cavallo Etanolo 0.500 Anidrasi carbonica Eritrociti Anidride carbonica 7.500 Aspartato aminotransferasi Cuore di maiale Acido aspartico 0.900 Acido a-chetoglutarico 0.100 Acido ossalacetico 0.040 acido glutammico 4.000 Butirril-CoA deidrogenasi Fegato di bue Butirril-CoA Chimotripsina Pancreas bovino N-benziltirosinamide 2.500 N-formiltirosinamide 12.000 N-acetiltirosinamide 32.000 gliciltirosinamide Creatina fosfochinasi Creatina 19.000 Esochinasi Lievito Glucosio 0.150 Cervello 0.008 Fosfatasi acida Prostata a-glicerofosfato 3.000 Fosfogliceraldeide deidrogenasi Gliceraldeide-3-fosfato 0.050 Glutamato deidrogenasi Fegato bovino Acido glutammico 0.120 2.000 Ione ammonio 57.000 NAD+ 0.025 NADH 0.018 Xantina ossidasi Latte Xantina 0.030 Acetaldeide V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

62 Enzima Sorgente Substrato Km (mM) n° di turnover (1/s) Acetil-CoA sintasi Cuore di bue Acetato 1.400 ATP-asi Muscolo di coniglio ATP 0.014 Alcool deidrogenasi Fegato di cavallo Etanolo 0.500 Anidrasi carbonica Eritrociti Anidride carbonica 7.500 Aspartato aminotransferasi Cuore di maiale Acido aspartico 0.900 Acido a-chetoglutarico 0.100 Acido ossalacetico 0.040 acido glutammico 4.000 Butirril-CoA deidrogenasi Fegato di bue Butirril-CoA Chimotripsina Pancreas bovino N-benziltirosinamide 2.500 N-formiltirosinamide 12.000 N-acetiltirosinamide 32.000 gliciltirosinamide Creatina fosfochinasi Creatina 19.000 Esochinasi Lievito Glucosio 0.150 Cervello 0.008 Fosfatasi acida Prostata a-glicerofosfato 3.000 Fosfogliceraldeide deidrogenasi Gliceraldeide-3-fosfato 0.050 Glutamato deidrogenasi Fegato bovino Acido glutammico 0.120 2.000 Ione ammonio 57.000 NAD+ 0.025 NADH 0.018 Xantina ossidasi Latte Xantina 0.030 Acetaldeide V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

63 Linearizzazione dell’equazione di Michaelis e Menten
V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

64 Lineweaver-Burk Inversione V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica

65 Lineweaver-Burk 1/v 1/Vmax Pendenza = KM/Vmax -1/KM 1/[S]
1/[S] V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

66 Eadie-Hofstee Trasformazione v/[s] v Vmax/KM Pendenza = - 1/KM Vmax
V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

67 Eadie-Hofstee (oppure)
Trasformazione Vmax v Pendenza = - KM Vmax/KM v/[s] V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

68 Reazioni enzimatiche con più substrati
Meccanismo sequenziale: i substrati si legano in modo sequenziale: Prima uno poi l’altro in ordine preciso: Meccanismo sequenziale ordinato Senza un ordine preciso: Meccanismo sequenziale casuale Meccanismo a ping-pong V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

69 Meccanismo sequenziale ordinato
V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

70 Meccanismo sequenziale casuale
V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

71 Meccanismo a ping-pong
V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

72 Meccanismo a ping-pong
Così funziona l’esochinasi V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

73 Esempio 1) Saccarosio fosforilasi
glucosio-fruttosio + fosfato  glucosio-1-fosfato + fruttosio Esperimento di scambio isotopico: glucosio-fruttosio + fruttosio*  glucosio-fruttosio* + fruttosio Il meccanismo è a ping pong 1) Maltosio fosforilasi glucosio-glucosio + fosfato  glucosio-1-fosfato + glucosio Esperimento di scambio isotopico: glucosio-glucosio + glucosio*  glucosio-glucosio + glucosio Il meccanismo è sequenziale V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

74 Es. Meccanismo sequenziale ordinato: reazioni aventi NAD+ e NADH come substrati
La lattato deidrogenasi catalizza questa reazione: si lega prima il coenzima che viene anche rilasciato per primo. La sequenza di eventi è ben rappresentata con il sistema sviluppato da W.Wallace Cleland: L’enzima forma sempre un complesso ternario: prima costituito dall’ enzima e dai substrati e dopo la catalisi dall’ enzima e dai prodotti V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

75 Nel meccanismo sequenziale casuale l’ordine con cui i substrati vengono legati e i prodotti rilasciati è casuale La creatina chinasi catalizza questa reazione. Anche in questo caso la sequenza della reazione può essere rappresentata con il sistema di Cleland V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

76 Reazioni a doppio spiazzamento (ping pong)
Uno o più prodotti vengono rilasciati prima che tutti i substrati si siano legati all’enzima. La caratteristica di questo tipo di reazione è la presenza di un intermedio costituito dall’enzima modificato. Un classico esempio sono gli scambi di gruppi amminici tra amminoacidi e α-chetoacidi. L’enzima aspartato ammino-transferasi catalizza questa reazione V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

77 La sequenza degli eventi può essere rappresentata dal seguente sistema:
Nel sistema di Cleland i substrati entrano ed escono dall’enzima come una pallina di ping-pong su un tavolo da gioco V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

78 Reazioni enzimatiche con più substrati
Il trattamento è complesso, occorre fare lo studio cinetico tenendo fissa la concentrazione di uno dei substrati (B) variando l’altro (A), così, di grafici di Lineweaver-Burk si può avere una descrizione del meccanismo: 1/[A] 1/v [B] Sequenziale casuale Ping-pong V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

79 Regolazione dell’attività enzimatica
I fattori che regolano l’attività enzimatica sono: Temperatura Enzimi solubili o di membrana pH Effettori Inibitori (inattivatori) Attivatori Effetti allosterici Concentrazione di substrati e prodotti Vie metaboliche Repressione o induzione genica V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

80 Temperatura La velocità delle reazioni chimiche dipende dalla temperatura. La stabilità di una proteina dipende dalla temperatura. Denaturazione Aumento cinetico optimum Velocità Temperatura V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

81 Temperatura La temperatura influenza la fluidità di membrana
Enzima solubile Enzima di membrana Temperatura di transizione della fase lipidica Ln v Ln v Temperatura alta 1/T Temperatura bassa Temperatura alta 1/T Temperatura bassa V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

82 pH La stabilità di una proteina dipende dal pH.
Alcuni processi coinvolgono valori estremi di pH Pepsina Tripsina Aceticolinesterasi Velocità relativa 2 6 pH 10 V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

83 Effettori Attivatori Inibitori
La differenza non è netta, la stessa molecola può funzionare in entrambi i modi a seconda delle condizioni Carica Concentrazione Enzima legato ad altre molecole … V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

84 Inibitori Si definiscono inibitori quelle molecole che diminuiscono l’attività di un enzima, possono dare Inibizione reversibile Modificano in modo reversibile (in genere attraverso un legame non covalente) l’enzima Inibizione irreversibile Modificano in modo irreversibile l’enzima V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

85 Inibitori reversibili
A secondo delle loro caratteristiche si definiscono: Inibitori competitivi Inibitori non competitivi Inibitori acompetitivi V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

86 Inibitori competitivi
Agiscono competendo con il substrato per lo stesso sito di legame, agiscono quindi sulla formazione del complesso ES. L’inibizione è rimossa aumentando la concentrazione di S V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

87 Inibitori competitivi
Senza inibitore Con inibitore V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

88 Inibitori competitivi
Senza inibitore Con inibitore V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

89 Inibitori competitivi
SUBSTRATO INIBITORE Sono molecole simili al substrato Occupano lo stesso sito di legame SITO ATTIVO DELL’INZIMA SUBSTRATO ED INIBITORE SI LEGANO ALLO STESSO SITO PRODOTTI IL LEGAME DELL’INIBITORE PREVIENE IL LEGAME DEL SUBSTRATO V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

90 Inibitori competitivi
Sono molecole simili al substrato Occupano lo stesso sito di legame V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

91 Inibitori non competitivi
Agiscono legandosi in un sito diverso dal sito di legame del substrato il quale può comunque legarsi. L’inibizione NON è rimossa aumentando la concentrazione di S V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

92 Inibitori non competitivi
Senza inibitore Con inibitore V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

93 Inibitori non competitivi
Senza inibitore Con inibitore V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

94 Inibitori non competitivi
INIBITORE SITO ATTIVO DELL’INZIMA Sono molecole diverse dal substrato, si legano ad un proprio sito Ioni metallici (Cu++) Complessanti (EDTA) Modulatori SUBSTRATO SITO INIBITORIO (REGOLATORIO) SUBSTRATO ED INIBITORE SI LEGANO A SITI DIVERSI IN ASSENZA DI INBITORE SI FORMANO I PRODOTTI LA PRESENZA DELL’INIBITORE RIDUCE LA VELOCITÀ DI FORMAZIONE DEL PRODOTTO V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

95 Inibitori acompetitivi
Agiscono legandosi e bloccando il complesso enzima-substrato. V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

96 Inibitori acompetitivi
Senza inibitore Con inibitore V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

97 Inibitori acompetitivi
Senza inibitore Con inibitore V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

98 Riassumendo… Inibizione competitiva Inibizione non competitiva
Inibizione acompetitiva V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

99 …riassumendo Tipo di inibizione VMAXapp KMapp Nessuna VMAX KM
Competitiva aKM Non competitiva VMAX/a’ aKM /a’ Acompetitiva VMAX /a’ KM /a’ V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

100 Inibitori irreversibili
Inibitore Formula Origine Meccanismo Ione cianuro CN- Mandorle amare Complessa gli ioni metallici nelle proteine Diisopropil fluorofosfato (DFP) Sintetico Inibisce gli enzimi con serina nel sito attivo Sarin Come il DFP Fisostigmina Frutto del calabar V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

101 Inibitori irreversibili
Inibitore Formula Origine Meccanismo Parathion Sintetico Come il DFP (particolarmente attivo su acetilcolinesterasi di insetti) N-tosil-L-fenilalanina clorometil chetone (TPCK) Reagisce con l’His-57 della chimotripsina Penicillina Penicillum Notatum Inibisce gli enzimi della sintesi della parete batterica V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

102 Attivatori Sono molecole che aumentano (o permettono) l’attività enzimatica Protezione dell’enzima Glutatione Ioni metallici Attivazione per azione sulle subunità Azione proteolitica su proenzimi Enzima inattivo + cAMP  Subunità + Subunità catalitica regolatrice V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

103 Procarbossipeptidasi
Attivatori Azione proteolitica su proenzimi Tripsinogeno Chimotripsinogeno p-chimotripsina a-chimotripsina + + Enteropeptidasi Tripsina Proelastasi Elastasi + Procarbossipeptidasi Carbossipeptidasi + V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

104 Effetti allosterici Un enzima allosterico è, in genere, un oligomero con subunità correlate. Gli effetti allosterici consistono nel legame di un effettore ad un sito diverso da quello del substrato con conseguente variazione delle proprietà cinetiche dell’enzima. L’effettore può essere lo stesso substrato (effettori omotropici) o diverso (effettori eterotropici). Sito attivo Sito dell’effettore V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

105 Effetto allosterico Un enzima allosterico è un oligomero con subunità correlate la cui attività (Km) viene influenzate dal legame del substrato V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

106 Effetti allosterici Il legame con l’effettore modifica (modula) le proprietà di legame del substrato. La velocità dipende da [S] come una sigmoide. n = indice di cooperatività Emoglobina V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

107 Vie metaboliche Una via metabolica è data da un insieme di reazioni catalizzate da enzimi che si susseguono l’una all’altra. Le vie metaboliche sono regolate: Inibizione da prodotto Attivazione da substrato V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

108 Vie metaboliche ramificate
Inibizione multivalente Inibizione cooperativa V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

109 Vie metaboliche ramificate
Inibizione cumulativa Inibizione di enzimi multipli V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica

110 Catabolismo e anabolismo
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111 Regolazione genica Un’altra via con la quale viene regolata l’attività di uno o più enzimi è attraverso l’induzione o la repressione genica della sintesi proteica di quella proteina con attività enzimatica. Anche per gli enzimi esiste una sorta di omeostasi. V.1.3 © gsartor Cinetica enzimatica