R + P RP C RP O RP I RP E Trascritti abortiti k1k1 k -1 k2k2 k -2 k3k3 k -3 k4k4 Costante di equilibrio: K I K I = RP C /(R + P) NTPs La velocità di formazione.

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2 R + P RP C RP O RP I RP E Trascritti abortiti k1k1 k -1 k2k2 k -2 k3k3 k -3 k4k4 Costante di equilibrio: K I K I = RP C /(R + P) NTPs La velocità di formazione del complesso aperto è k 2 Questa transizione è la “promoter clearance”- con velocità k 4 Controllo della Trascrizione

3 Il problema del riconoscimento del DNA Il genoma umano contiene 3 · 10 9 coppie di basi (bp) Le proteine che legano il DNA devono individuare siti di azioni UNICI nel genoma –Promotori –Origine della Replicazione –Posizioni dove il DNA è danneggiato –…

4 Composizione del DNA Basi Nucleotidiche Deossiribosio Fosfati Acqua (36-46 molecole per bp) Ioni / Leganti –0.75 ioni monovalenti/PO 4

5 Nei genomi più sempici Procarioti (p.es. E. coli) 5 · 10 6 bp –3-4 ordini di grandezza più semplice del genoma umano o delle piante L’evoluzione ha prodotto proteine che riconoscono siti di 8-10 basi –La frequenza casuale è 2·10 -5 - 1·10 -6 –Alta selettività

6 Cosa è riconosciuto? La struttura MEDIA del DNA Due catene polianioniche con solchi di geometria diversa –Major groove: ampio, piatto –Minor: stretto, profondo Contraioni e idratazione Flessibilità (dinamica)

7 Gruppi funzionali delle basi Accettori/donatori di legami a idrogeno Superfici di interazione di van der Waals

8 Gruppi funzionali del backbone Ripetuti – ma non equivalenti Gruppi fosfato – controioni –Il DNA ha alta densità di carica Contraioni: K +, Na +, Mg ++, poliammidi (p.es. spermidina) –L’identità dei controioni dipende dalla sequenza e della cellula Deossiribosio –Diversità conformazionale –Distingue ssRNA dal ssDNA

9 Le proteine riconoscono il DNA generalmente nel major groove

10 Esempio di riconoscimento nel major groove

11 Proteine zinc finger, tipo CCHH. Alcuni monomeri, altri dimeri. Spesso sono presenti più di un finger e quindi la superficie di riconoscimento può essere ampia. Il riconoscimento delle basi è dato dalle catene laterali degli a.a.

12 Helix turn helix. Molti regolatori procariotici sono del tipo helix turn helix. Legano come dimeri. Il riconoscimento delle basi è dato dalle catene laterali degli a.a. che fuoriescono dalle eliche Homeotic selector gene Regolatori batterici

13 Leucine zipper protein. Dimero coiled-coil contenente leucine ogni 7 amino acidi e un residuo idrofobico ogni 3-4 a.a. Helix-loop-helix protein. Diverso da helix-turn-helix!

14 Vantaggi della dimerizzazione: La formazione di diversi eterodimeri consente di riconoscere un numero maggiore di sequenze di basi a parità di proteine Il riconoscimento può essere represso tramite la formazione di eterodimeri in cui una subunità è priva del dominio di legame del DNA I leganti possono causare cambiamenti allosterici che alterano la posizione reciproca dei domini che riconoscono il DNA Modificazioni post-traduzionali come la fosforilazione e l’acetilazione possono promuovere o inibire la dimerizzazione e quindi determinare il legame

15 Il legame come omo o eterodimeri aumenta il reportorio di siti riconosciuti Il legame di piccole molecole determina il riposizionamento dei domini che legano il DNA, in modo da allinearli con il solco maggiore Partner di eterodimerizzazione privi del dominio di legame del DNA fungono da repressori

16 La trascrizione nei batteri è generalmente sottoposta ad un controllo di tipo negativo in cui la RNA polimerasi oloenzima (associata al fattore sigma) si lega direttamente al promotore, dirigendo la trascrizione del gene immediatamente a valle a meno che venga repressa dalla presenza di un repressore. Il promotore è la regione di DNA al 5’ di un gene, dove si lega la RNA polimerasi. L’analisi della sequenza dei primi promotori non rivelò, come atteso, la stessa sequenza ma regioni molto eterogenee all’interno delle quali si riconoscevano due sequenze conservate una a -10, con consensus TAATAT e un altra a -35 con consensus TTCAGA. Studi più recenti hanno caratterizzato un’altra regione regolativa, detta UP Situata ancora più a monte. promotori procariotici +1 ACCATG TTCAGA AGCATTCTCAACTGGTATAGTTAACTATAAT CTGGATTC Promotore procariotico -35-10 Studi di footprinting e analisi di mutazioni hanno confermato l’importanza funzionale di queste regioni regolative.

17 P.es.: arginina, uno dei 20 amino acidi essenziali I batteri possono produrre arginina, ma se ne trovano nell’ambiente non esprimono i corrispondenti geni per la biosintesi Niente arginina La cellula deve produrne Il repressore non lega Geni x biosintesi espressi Alta [] di arginina Non c’è bisogno di produrne Il complesso repressore + Arg lega I geni x biosintesi non sono espressi Arginine Meccanismo di repressione o co-repressione

18 P.es.: lattosio I batteri usano il lattosio come fonte di carbonio se presente, ma altrimenti non c’è bisogno di esprimere i geni per l’uso In presenza di lattosio La cellula lo usa come nutriente Il complesso repressore+lattosio si stacca dal DNA Gli enzimi lac sono espressi Lactose Meccanismo di repressione inducibile Niente lattosio Il repressore lega all’operatore dell’operatore lac Nessun enzima è espresso

19 I promotori regolati da fattori sigma alternativi possono avere sequenze consenso diverse

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21 Published by AAAS M. Rappas et al., Science 307, 1972 -1975 (2005) Fig. 1. EM analysis of the PspF(1-275)-ADP.AlFx-{sigma}54 complex  54

22 P.es.: maltosio I batteri usano maltosio se presenti, ma non esprimono i corrispondenti geni se il maltosio non è presente. (Cfr. lattosio) Promotore debole Maltosio Meccanismo di attivazione della trascrizione In presenza di maltosio La cellula lo usa come nutriente Il complesso attivatore+maltosio lega il DNA Gli enzimi mal sono espressi Niente maltosio L’attivatore non lega il DNA Nessun enzima è espresso

23 αNTD: amino-terminal domain of the RNAP α subunit αCTD: carboxy-terminal domain of the RNAP α subunit ATTIVATORI TRASCRIZIONALI Barnard A. et al., Current Opinion in Microbiology Volume 7, 2004, pp.102-108 Class I – upstream of –35 Class II – overlaps with –35

24 La stessa proteina può fare da attivatore e repressore Multipartite repression loop Class I transcription activator Schleif, 1996, Chapter 83, Escherichia coli and Salmonella, ASM Press 1. Forte repressione in assenza di arabinosio e presenza di glucosio 2. Forte attivazione in presenza di arabinosio

25 1 operone 2 operoni

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27 Regolazione (negativa) della degradazione del bifenile in Pseudomonas KKS102 HOPDA Gli enzimi sono espressi debolmente in assenza di bifenile Gene, Volume 256, 2000, Pages 223-228 Y. Ohtsubo et al.

28 Regolazione della degradazione del bifenile in P. pseudoalcaligenes KF707: due regolatori 1 2 La regolazione di BphR2 non è nota

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30 Saggi per la caratterizzazione delle proteine che legano sequenze promotrici A T G 5’3’ trascrizione -35 T A T A A ATAT TATA box 1.DNA mobility shift assays 2.DNase I footprinting assays ?

31 Saggio di ritardo elettroforetico (EMSA) Se si sospetta e si vuole confermare la presenza di una regione di legame al DNA uno dei metodi più immediati è quello noto come gel shift o EMSA (electrophoretic mobility shift assay) o bandshift o gel di ritardo elettroforetico. E’ una tecnica relativamente semplice ma con un potere di risoluzione modesto. Consiste essenzialmente nella preparazione di un estratto nucleare che viene mescolato in vitro, in appropriate condizioni sperimentali, con un frammento marcato contenente la regione di legame putativo. Se una o più proteine dell’estratto si legano al frammento di DNA marcato, la sua mobilità elettroforetica in un gel di poliacrilammide o agarosio diminuirà, come se il frammento fosse rallentato. Il ritardo elettroforetico può essere facilmente evidenziato comparando la mobilità elettroforetica di un frammento di controllo senza estratto proteico.

32 1.DNA mobility shift assays (gel-shift assays) Protein fractions separated by column chromatography assayed for ability to bind to radiolabeled DNA fragment containing a known regulatory element Successive column fractions protein extract

33 Electrophoretic Mobility Shift Assay - “EMSA”, “gel-shift”.

34 promotore libero Complessi proteine-DNA TFIID A A TFIIB 1 2 3 4 5 TFII E- - - - - - + Pol II- - - - - + + TFII F- - - - + + + TFII B- - - + + + + TFII A- - + + + + + TFII D- + + + + + + TFIID A TFIIB F TFIID A TFIIB F Pol II TFIID A TFIIB Pol II E F 6

35 DNA footprinting 5’* Marcatura terminale 5’* Aggiungere il fattore di trascrizione 5’* Digestione parziale con la DNAsi I 5’* Il DNA footprinting è una tecnica che riesce a determinare l’esatta posizione della proteina legata. Un frammento di DNA, supposto contenere una regione di legame, viene marcata terminalmente, fatta interagire con la proteina in esame, e digerita parzialmente con la DNasi I. L’eventuale legame alla proteina proteggerà la regione di legame dalla degradazione endonucleasica. nessun taglio in questa regione

36 DNase I Footprinting Pancreatic DNase I is a relatively nonspecific endonuclease.

37 TATACGCTGATTGATTCGGACCCCACGGATTTATACGCTGATTGATTCGGACCCCACGGATT -20 -30 -40 -10 Regione - 10 Regione - 35 Footprinting del promotore UV5: La RNA polimerasi protegge una regione di circa 50-60 bp contattando le regioni -10 e -35

38 Figure 34-53aIdentification of the Sp1-binding sites on the SV40 early promoter (Fig. 34-52, top).

39 two-component regulatory system: signal transduction: sensor kinase auto- phosphorylates in response to signal response regulator phosphorylated in turn phosphorylated regulator acts (e.g., DNA-binding repressor or activator) phosphatase activity removes PO 4

40 numerous two-component regulatory systems are known:

41 Quorum sensing: Un tipo di sistema di controllo che consente la regolazione dell’espressione genica in risposta alla densità della popolazione Il “segnale” = presenza di altri microorganismi Molecole segnale diffusibili (e.g., acylated homoserine lactone, AHL) possono essere prodotte ed escrete da tutte le cellule in una popolazione Una maggior densità della popolazione risulta in una maggiore concentrazione di AHL Le molecole di AHL attivano specifici attivatori trascrizionali → risulta nell’induzione di trascrizione specifica

42 bioluminescent Vibrio fischeri photo taken in dark room; light generated solely by luciferase-expressing bacteria growing on the streak plate

43 Vibrio bioluminescence: Vibrio fischeri inhabits the open sea (in low densities), as well as the light organs of squid (in high densities) luminescence occurs only at high bacteria cell concentrations

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45 quorum-sensing model

46 Bioresource technology, 2013