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Università del Piemonte Orientale – Facoltà di Scienze – anno accademico 2006-2007 Carne e pesce Carne e pesce sono, insieme alle uova, tra le più importanti.

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1 Università del Piemonte Orientale – Facoltà di Scienze – anno accademico Carne e pesce Carne e pesce sono, insieme alle uova, tra le più importanti fonti di proteine nella dieta umana. Si tratta inoltre di alimenti consumati dalluomo fin dalla preistoria Lanalisi di carne e pesce è generalmente più complessa rispetto agli alimenti citati in precedenza, soprattutto per il fatto che si tratta di substrati non omogenei, in cui le varie sostanze sono presenti in più forme fisiche. Per questo motivo è quasi sempre necessario un passaggio preliminare di estrazione dellanalita

2 Con il termine carne si intendono i muscoli striati e i tessuti strettamente connessi di: Allinterno degli organismi di questi animali, altre parti che sono generalmente associate alla carne dal punto di vista merceologico sono le frattaglie (i principali organi interni), la trippa (stomaco e intestino) e le animelle (pancreas, timo, ghiandole salivari) animali da macello (bovini, suini, ovini, caprini, equini) animali da macello (bovini, suini, ovini, caprini, equini) animali da cortile (pollame, tacchini, conigli) animali da cortile (pollame, tacchini, conigli) selvaggina selvaggina La carne

3 Le carni destinate allalimentazione possono essere classificati in alcuni modi, ad esempio in base alla specie animale da cui provengono. Importante è la classificazione in base ai trattamenti subiti prima del consumo. Si possono avere allora: Classificazione delle carni le carni fresche, che abbiano subìto soltanto trattamenti refrigeranti le carni fresche, che abbiano subìto soltanto trattamenti refrigeranti le carni sterilizzate, come la carne in scatola, per la cui preparazione è consentito luso di additivi (nitrati e nitriti, antiossidanti, addensanti, gelificanti, esaltatori di sapidità) le carni sterilizzate, come la carne in scatola, per la cui preparazione è consentito luso di additivi (nitrati e nitriti, antiossidanti, addensanti, gelificanti, esaltatori di sapidità) le carni salate e/o essiccate e/o affumicate e/o cotte: i salumi, insaccati o non, che possono contenere numerosi additivi le carni salate e/o essiccate e/o affumicate e/o cotte: i salumi, insaccati o non, che possono contenere numerosi additivi

4 La composizione della carne varia ovviamente a seconda della specie, delletà, dello stato nutrizionale e dellalimentazione dellanimale Composizione Classe range % Acqua Proteine 15 – 23 Composti azotati non proteici Lipidi Carboidrati1.2 Sali minerali 1 Vitaminetracce

5 La variazione da specie a specie è mostrata in questa tabella Tipo di carne acqua%proteine%grassi%colesterolo mg/100 g calorie Kcal/100 g ovino bovino suino pollo tacchino oca lepre

6 La carne dal punto di vista analitico è una matrice piuttosto complessa, sicuramente più di quelle finora trattate. Siccome la maggior parte dei test analitici si effettua per via umida, il pretrattamento del campione risulta critico nella possibilità di ottenere risultati affidabili; in particolare è necessario porre molta attenzione nel campionamento, a causa della scarsa omogeneità di composizione Problemi nellanalisi Generalmente la preparazione del campione prevede la rimozione di tutte le parti accessorie al muscolo (ossa, pelle, tendini) e il prelievo di un pezzo della parte edibile che viene omogeneizzato mediante triturazione e amalgamazione (a sx lo strumento impiegato); questo passaggio può essere coadiuvato dallacqua, anche perché è necessario mantenere la temperatura bassa (< 7°C) Le analisi devono essere eseguite nel più breve tempo possibile, soprattutto per le carni fresche

7 Le principali analisi che si eseguono sulle carni sono le seguenti: Principali analisi per le carni fresche contenuto di acqua contenuto di acqua contenuto di proteine e azoto solubile (non proteico) contenuto di proteine e azoto solubile (non proteico) ceneri ceneri contenuto di sostanza grassa contenuto di sostanza grassa ricerca di anabolizzanti ricerca di anabolizzanti tenore di idrossiprolina tenore di idrossiprolina nitrati e nitriti nitrati e nitriti metalli pesanti metalli pesanti

8 Un aspetto complesso riguardante la genuinità della carne è la sua provenienza: è possibile certificarla con metodi analitici? Inoltre, è possibile distinguere carne da allevamento biologico da carne di allevamento intensivo? Il consumatore è sicuramente interessato a sapere, e quindi a verificare l'autenticità dell'informazione, se la carne che mangia proviene da allevamenti biologici (organic farming in inglese) o da allevamenti intensivi (factory farming) Carne biologica o industriale?

9 Un esempio di quanto sia semplice frodare la legge sulla produzione biologica di carne è il seguente. In Gran Bretagna è stata avviata (maggio 2006) unindagine nazionale sulla vendita di falsa carne biologica nelle macellerie e nei mercati. Si sospetta infatti che alcuni macellai vendano carne convenzionale per biologica, naturalmente incassando il prezzo della carne bio, che può essere anche di cinque volte superiore. In Gran Bretagna un pollo del valore di 2-3 sterline (3-4.5 ) può valerne ( ) con un'etichetta biologica; la bistecca convenzionale che si vende a sterline (14-22 ) al chilo, può arrivare fino a sterline (43.5 euro) se biologica. Il reato comporta pochi rischi perché è molto difficile per i clienti accorgersi di essere stati frodati, a meno che dispongano di strumentazioni analitiche fatte in casa

10 Attraverso l'analisi dei rapporti isotopici di C, N e S si può avere uno strumento utile per verificare la provenienza geografica della carne, in particolare di quella bovina, e avere informazioni sul tipo di alimentazione del bestiame In un recente studio effettuato da ricercatori irlandesi sono stati messi a confronto campioni di carne bovina proveniente da bestie allevate in USA, Brasile e Nord Europa. Le differenze nella marcatura isotopica della carne sono causate principalmente dall'alimentazione e riflettono le proporzioni di piante con cammino fotosintetico C 3 e C 4 nella dieta degli animali. Nello stesso studio si vede come sia possibile, per le stesse ragioni, differenziare carne da bovini allevati con metodi biologici o con metodi intensivi al'interno di una stessa regione geografica, l'Irlanda

11 La determinazione del rapporto isotopico 13 C/ 12 C contro 15 N/ 14 N fornisce un risultato sorprendente: l'ottima separazione tra campioni di provenienza americana ed europea. Ciò è legato senza dubbio all'impiego quasi esclusivo, nell'alimentazione dei capi americani, di piante C 4 come il granturco o erbe subtropicali: ciò causa valori di 13 C meno negativi (tra -12 e -8) per le carni provenienti dal continente americano C'è buona separazione anche tra campioni di carne irlandese e campioni di altra provenienza europea

12 pallini neri: allevamento biologico pallini bianchi: allevamento intensivo La carne convenzionale presenta valori di 13 C meno negativi (-24.5 ± 0.7) rispetto alla carne biologica (-26.0 ± 0.2), come ci si può aspettare se si pensa ad unalimentazione basata su mangimi concentrati o su erba. Per i campioni di carne convenzionale con valori più negativi di -24 si può ipotizzare limpiego di mangimi contenenti piante C 4 (mais, melassa di canna da zucchero) Considerando lazoto, la carne convenzionale presenta valori di d 15 N più elevati (7.8 ± 0.4) di quelli di carne biologica (6.6 ± 0.4). Il motivo di questa differenza è meno chiaro: si può pensare all'influenza del contenuto di legumi nella dieta biologica. Un discorso analogo può valere per la differenza riscontrata nei valori di δ 34 S (7.9 per il biologico, 7.2 per il convenzionale), forse legata all'impiego, nella dieta biologica o come fertilizzante, di alghe, organismi che presentano un arricchimento di 34 S

13 La quantità di acqua presente nella carne fresca è un parametro importantissimo per determinarne la genuinità, soprattutto quando messo in relazione al contenuto di proteine. Il rapporto acqua/proteine è infatti una costante biologica indipendente da specie animale, razza e alimentazione: esso è compreso tra Valori maggiori indicano probabilmente unaddizione fraudolenta di acqua per iniezione o immersione (es. bistecca che si ritira in fase di cottura) Percentuali maggiori di acqua (ma sempre in accordo al suddetto rapporto) si possono avere in carne da individui giovani e magri e in muscoli che si muovono di più, come i quarti anteriori Determinazione del contenuto di acqua

14 La maggior parte dellacqua contenuta nella carne è in forma libera o acqua di imbibizione, trattenuta meccanicamente dalle strutture proteiche. Soltanto il 4% del totale è legata elettrostaticamente ai gruppi polari delle proteine. Entrambe le forme sono cedute facilmente per riscaldamento La determinazione dellacqua è semplice: si effettua mediante essiccazione del campione in stufa a 180°C. La differenze di peso prima e dopo il prosciugamento rappresenta la quantità di acqua presente

15 Il contenuto di proteine si determina mediante il noto metodo di Kjeldhal: Il metodo, impiegato per la caratterizzazione di numerosi alimenti, fornisce in realtà un dato corrispondente allazoto totale presente nel campione. Per avere il dato relativo alle proteine, la quantità di azoto determinata deve essere moltiplicata per un fattore specifico del tipo di alimento. Nel caso della carne esso è pari a 6.25 (per confronto, il valore per il latte è 6.38, per gli sfarinati 5.7) Contenuto di proteine proteine digestione con H 2 SO 4 + catalizzatore (Cu, Hg) NH 4 SO 4 addizione di idrossido NH 3 distillazione di NH 3 su volume noto di HCl 0.1 N NH 4 Cl titolazione delleccesso di HCl con NaOH titolazione delleccesso di HCl con NaOH

16 Oltre alla determinazione dellazoto proteico, è interessante nella carne determinare anche il tenore di azoto non proteico o solubile, presente per circa il 2% e costituito da numerosi composti quali amminoacidi liberi e oligopeptidi, ammine, nucleosidi e nucleotidi, basi azotate pirimidiniche e puriniche, creatina e creatinina, urea e ammoniaca La determinazione avviene stemperando il campione tritato in acqua e titolando lazoto sulla soluzione filtrata dopo precipitazione delle proteine solubili con acido tricloroacetico. In questo caso il fattore di conversione per passare dallazoto ai composti è pari a 10 N solubile

17 Se ne determina il peso dopo calcinazione in muffola del campione posto in crogiolo di porcellana. Sulle ceneri è possibile determinare lalcalinità, il contenuto di metalli e anioni, ecc. Ceneri

18 Si determina con un metodo ponderale, il metodo Soxhlet dal nome del noto sistema di estrazione Determinazione della sostanza grassa Il metodo si basa appunto sullestrazione del grasso dal campione secco, previa essiccazione e disidratazione con solfato di sodio anidro. Si estrae con etere di petrolio per 10 ore; alla fine, dopo aver allontanato il solvente per evaporazione, si pesa il residuo costituito da grassi direttamente nel pallone di raccolta precedentemente tarato Con opportune strumentazioni, la procedura è automatizzabile d eseguibile su più campioni contemporaneamente

19 La determinazione degli anabolizzanti nella carne è molto importante, per via degli aspetti legati allazione che residui di questi composti possono avere sulla nostra salute, sotto forma di patologie varie. Si tratta di un campo complesso, in ragione del Ricerca degli anabolizzanti gran numero di sostanze impiegate in maniera fraudolenta. Limpiego di anabolizzanti per promuovere la crescita e aumentare il rapporto carne/grasso negli animali è stato bandito nellUE dal 1988 ma non in paesi come USA, Canada, Australia, Nuova Zelanda, Sudafrica e Messico In parallelo è cresciuta la necessità di metodi danalisi robusti e accurati

20 Esistono tre modalità di analisi: Esami istologici e istochimici: accertano lavvenuto trattamento, sono aspecifici e non dimostrano la presenza di residui negli animali esaminati Esami istologici e istochimici: accertano lavvenuto trattamento, sono aspecifici e non dimostrano la presenza di residui negli animali esaminati Prove biologiche (somministrazione di un campione sospetto ad animali da esperimento): sono aspecifiche, rivelano la presenza di residui di sostanze ad attività estrogena che non sono inattivate a livello gastrico Prove biologiche (somministrazione di un campione sospetto ad animali da esperimento): sono aspecifiche, rivelano la presenza di residui di sostanze ad attività estrogena che non sono inattivate a livello gastrico Esami chimici: metodi di screening (RIA, ELISA, TLC, HPLC), metodi di conferma (GC-MS, HPLC-DAD, HPLC-MS, GC-MS, GC- MS/MS), evidenziano la singola molecola Esami chimici: metodi di screening (RIA, ELISA, TLC, HPLC), metodi di conferma (GC-MS, HPLC-DAD, HPLC-MS, GC-MS, GC- MS/MS), evidenziano la singola molecola Le tecniche cromatografiche, pur richiedendo procedure laboriose di preparazione del campione, consentono di identificare e quantificare un numero elevato di sostanze attive. Peraltro, il Parlamento Europeo ha recentemente approvato una normativa sulle performances richieste dai metodi analitici, secondo la quale è necessario limpiego di sistemi di rivelazione più efficienti dei convenzionali detector. Spazio, quindi, alle tecniche GC-MS ed HPLC-MS

21 Alcuni anabolizzanti ad azione ormonale sono i seguenti: steroidi endogeni (naturali): 17 - estradiolo (dx alto), progesterone, testosterone (dx medio) steroidi endogeni (naturali): 17 - estradiolo (dx alto), progesterone, testosterone (dx medio) La complessità dellanalisi è aumentata dal fatto che spesso non si determinano direttamente le molecole anabolizzanti, ma i loro metaboliti. I quali, però, non sempre sono prodotti da un unico progenitore, es. il norandrosterone, considerato marcatore del nandrolone, è un metabolita anche di norandrostenediolo e norandrostenedione sostanze ormonoidi: DES (dietilstilbestrolo, dx), zearalenone sostanze ormonoidi: DES (dietilstilbestrolo, dx), zearalenone steroidi esogeni (sintetici): estradiolo benzoato, testosterone proprionato, trembolone acetato steroidi esogeni (sintetici): estradiolo benzoato, testosterone proprionato, trembolone acetato

22 Lapproccio convenzionale alla determinazione degli anabolizzanti nella carne con metodi cromatografici richiede uno step di estrazione e successivi passaggi di purificazione prima di procedere allanalisi. Lestrazione con solventi è selettiva nei confronti degli ormoni, ma generalmente una buona percentuale dei grassi presenti è coestratta, causando problemi in fase di eluizione cromatografica. I grassi possono essere allontanati per precipitazione a freddo dopo ultracentrifugazione Esempio di separazione cromatografica con GC-MS di ormoni (miscela standard addizionata ad un campione di carne). Gli analiti sono trasformati in eteri di trimetilsilano prima delliniezione in colonna

23 Separazione con HPLC- MS di anabolizzanti in prodotti per linfanzia a base di carne a)TIC b)corrente ionica di - e -zeranolo c)corrente ionica di - e -estradiolo e - estradiolo deuterato (standard interno) d)corrente ionica di dietilstilbestrolo

24 Una buona alternativa consiste nellimpiego della tecnica di immunoaffinità, che sfrutta una reazione tra lanalita ed un anticorpo specifico, in grado di legarlo; per questo motivo, essa risulta molto più selettiva rispetto alle tecniche estrattive convenzionali. Lestrazione si realizza mediante colonnine impaccate con un gel polisaccaridico di supporto a cui sono legati covalentemente gli anticorpi; il rilascio dellanalita si ottiene con un opportuno solvente che provoca una parziale denaturazione nella struttura dellanticorpo, permettendo il rilascio degli analiti La denaturazione è reversibile entro certi limiti: ricondizionando la fase legante con un opportuno tampone acquoso, con pH e forza ionica fisiologici, gli anticorpi riacquisiscono la loro capacità legante e quindi il materiale sorbente può essere riutilizzato

25 Il contenuto di idrossiprolina, amminoacido tipico delle proteine collagene ed elastina e assente in altre proteine, è un indice della percentuale di tessuto connettivo nelle carni e nei preparati a base di carne (es. salumi) ed è inversamente proporzionale alla loro qualità proteica e, quindi, commerciale La determinazione si effettua per via spettrofotometrica. Dopo idrolisi acida del campione di carne con HCl, lidrossiprolina è ossidata con clorammina T. Addizionando 4- dimetilamminobenzaldeide si sviluppa una colorazione rossa di cui si misura lassorbanza Determinazione dellidrossiprolina

26 Nitriti e nitrati sono sali di notevole importanza dal punto di vista tossicologico. Essi possono infatti generare nitrosammine, composti potenzialmente cancerogeni. La tossicità dei nitriti è chiaramente superiore e il suo legame con la formazione delle nitrosammine è più conclamato; tuttavia, anche in presenza di soli nitrati non può essere esclusa la possibilità di riduzione a nitriti. In particolare nello stomaco ci sono le condizioni perché avvenga la seguente reazione: NO H + + 2e - NO H 2 O Nitrati e nitriti possono entrare nella composizione delle carni in quanto assunti dagli animali tramite l'acqua e le verdure concimate con preparati a base di azoto Nitrati e nitriti

27 Oltre alla possibile presenza iniziale nella carne, queste sostanze sono ampiamente usate come additivi per prodotti carnei (E249 potassio nitrito, E250 sodio nitrito, E251 sodio nitrato e E252 potassio nitrato) in virtù delle proprietà ad ampio spettro che si possono riassumere nei seguenti punti: sicurezza microbiologica, in particolare nel prevenire lo sviluppo del botulino sicurezza microbiologica, in particolare nel prevenire lo sviluppo del botulino stabilizzazione del colore, in quantità tre volte superiori a quelle necessarie come conservanti stabilizzazione del colore, in quantità tre volte superiori a quelle necessarie come conservanti prevenzione dei fenomeni di ossidazione lipidica prevenzione dei fenomeni di ossidazione lipidica influenza sulla composizione aromatica, il tipico cured aroma, non ottenibile con altre tecniche di aromatizzazione influenza sulla composizione aromatica, il tipico cured aroma, non ottenibile con altre tecniche di aromatizzazione

28 I limiti di legge per le carni prevedono unaddizione massima di 150 mg/kg per i nitriti e 250 mg/kg per i nitrati. Da notare che un litro d'acqua che contenesse la quantità massima di nitriti o nitrati permessa per legge non sarebbe potabile, in quanto i limiti per lacqua sono rispettivamente 0 e 50 mg/l Attualmente sono allo studio sistemi alternativi che non implichino limpiego dei nitriti, per esempio addizionando zucchero e vitamina C (noto antiossidante). La comunità scientifica da un lato riconosce a nitrati e nitriti un ruolo non sostituibile di difesa contro le malattie di origine batterica, dallaltro è conscia della potenziale pericolosità associata alluso di queste sostanze

29 Con tali premesse è evidente l'esigenza di individuare un metodo analitico universale, di facile applicazione e accurato per determinare nitriti e nitrati in carni e salumi. Il metodo ufficiale per la determinazione nei prodotti carnei è per via spettrofotometrica ma prevede una procedura laboriosa e resa difficoltosa dalla complessità della matrice carnea, in cui si ritrovano macromolecole di differente natura. Inoltre, il metodo spettrofotometrico fa ricorso a reattivi tossici e richiede lunghi tempi di analisi. Il metodo è per questo motivo poco utilizzato Sono stati quindi sviluppati diversi metodi in HPLC, principalmente con sistema di rivelazione UV, ma per la scarsa sensibilità necessitavano di lunghi protocolli di clean-up durante la preparazione del campione

30 Per ovviare a questi inconvenienti, recentemente sono stati proposti metodi in cromatografia ionica, sia con sistema di rivelazione UV sia in conducibilità soppressa. Inoltre, recentemente al sistema ionico può essere accoppiato uno spettrometro di massa per la conferma dei picchi, nel tentativo di identificare i possibili interferenti. Il sistema IC-MS ha attualmente grandi potenzialità in campo agroalimentare Nei metodi di separazione cromatografica il passaggio critico è la preparazione dei campioni e in particolare la modalità di estrazione degli anioni dalla matrice proteica. Le possibilità sono due: estrazione mirata ad allontanare le sostanze interferenti (come i grassi), oppure estrazione selettiva per gli analiti. In questo secondo caso buona accuratezza e riproducibilità si ottengono con una semplice estrazione in fase acquosa in un omogeneizzatore, seguita da centrifugazione e filtrazione. Lanalisi dovrebbe essere completata dopo non più di 12 ore dallestrazione, per evitare la conversione di nitrito a nitrato

31 Determinazione di nitrato e nitrito in un campione di prosciutto mediante IC e rivelazione spettrofotometrica 1) nitrite, 1.16 ppm 2) nitrate, 0.54 ppm Colonna: Dionex IonPac AS11 e AG11 Eluente: NaOH 5 mM Rivelazione : UV, 225 nm

32 Il contenuto di metalli nella carne è un parametro di secondaria importanza. La carne contiene soprattutto metalli alcalini e alcalino-terrosi (K in quantità nettamente superiore, poi Mg, Ca e Na), oltre a discrete quantità di Fe e tracce di Cu, Mn, Zn, Co e Mo. Si tratta quindi di elementi desiderabili a livello fisiologico, per i quali lassunzione di carne rappresenta una buona fonte La possibilità che siano presenti dosi elevate di metalli pesanti (Cd, Hg, Pb) è alquanto bassa Metalli pesanti

33 Con il termine pesce si intendono le carni e le altre parti edibili di animali acquatici forniti dalle attività di pesca e dallacquacoltura. Più correttamente littiofauna è costituita da pesci veri e propri, molluschi, crostacei e altri gruppi di minor interesse È interessante notare che in tutto il mondo si consumano circa 1000 specie differenti di animali acquatici Prodotti ittici

34 La composizione del pesce è abbastanza simile a quella della carne, soprattutto per quanto riguarda la ripartizione dei macronutrienti. Le principali differenze riguardano: Composizione le caratteristiche delle proteine, responsabili della diversa consistenza delle carni le caratteristiche delle proteine, responsabili della diversa consistenza delle carni la diversa qualità dei grassi, in particolare la presenza degli acidi grassi polinsaturi omega 3 la diversa qualità dei grassi, in particolare la presenza degli acidi grassi polinsaturi omega 3 la presenza di particolari sostanze responsabili della deperibilità dei prodotti ittici e del loro odore peculiare la presenza di particolari sostanze responsabili della deperibilità dei prodotti ittici e del loro odore peculiare La composizione della carne varia ovviamente a seconda della specie, delletà, dello stato nutrizionale e dellalimentazione dellanimale

35 Classe range % Acqua 60 – 80 Proteine 15 – 25 Composti azotati non proteici 0.5 – 1 Lipidi 0.5 – 22 Carboidrati 0.5 – 1 Sali minerali Vitaminetracce I crostacei e i molluschi hanno caratteristiche leggermente diverse da quelle degli altri pesci, più simili a quelle del pesce magro

36 Caratteristica dei pesci marini è la presenza dellossido di trimetilammina o TMAO, un composto azotato solubile che dopo la morte dellanimale genera per reazioni batterica trimetilammina, dimetilammina e formaldeide, dando luogo al tipico odore sgradevole di pesce (CH 3 ) 3 NO (CH 3 ) 3 N Nei pesci dacqua dolce la perdita di freschezza è invece segnalata da derivati della piperidina (dx), composto eterociclico formatosi dalla lisina

37 Il campione sottoposto allanalisi deve essere sempre piuttosto voluminoso per ridurre al minimo le perdite di umidità. Lesemplare va pulito, eviscerato e deliscato; inoltre va rimossa la pelle, a meno che non sia necessario effettuare analisi del grasso o delle Problemi nellanalisi sostanze liposolubili. Il campione va poi finemente triturato e amalgamato in maniera analoga a quanto descritto per lanalisi della carne. Nel caso di analisi inorganiche, può essere semplicemente essiccato in muffola Il campione così trattato va mantenuto in un recipiente a tenuta daria in frigorifero fino al momento dellanalisi, che deve essere eseguita nel più breve tempo possibile

38 Anche per il pesce è prassi determinare parametri di routine come lumidità, le ceneri, lazoto proteico e totale, i grassi. In più cè una serie di analisi specifiche utili a saggiare lo stato di freschezza del prodotto relativamente a: Principali analisi per il pesce alterazione della frazione lipidica alterazione della frazione lipidica numero di perossidi numero di perossidi indice di acido tiobarbiturico indice di acido tiobarbiturico alterazione della frazione proteica o dei composti azotati alterazione della frazione proteica o dei composti azotati indice di ipoxantina indice di ipoxantina determinazione delle basi volatili determinazione delle basi volatili determinazione della TMA determinazione della TMA Ci sono poi test sulla genuinità del prodotto, relativi allidentificazione di diverse specie ittiche, e test riguardanti la presenza di sostanze tossiche

39 La determinazione del numero di perossidi è indicativa del grado di ossidazione primaria dei lipidi. Si esegue sulla frazione lipidica del campione di pesce, in maniera analoga alla stessa determinazione effettuata sullolio, ovvero con una titolazione iodometrica. Un volume noto di KI si mette a contatto con la frazione lipidica del campione; KI + -O-O- I 2 lo iodio liberato dallossidazione degli eventuali perossidi presenti è poi titolato con tiosolfato in presenza di indicatore salda damido Numero di perossidi

40 Si riferisce alla presenza di prodotti secondari dellossidazione dei lipidi, in particolare laldeide malonica. La determinazione è colorimetrica Dalla frazione lipidica estratta in solvente organico, laldeide è estratta in solvente acquoso in presenza del reattivo acido tiobarbiturico. Dopo riscaldamento, lestratto sviluppa un colore rosso di cui si misura lassorbanza in confronto a soluzioni standard Indice di acido tiobarbiturico

41 Si tratta di uno dei test più indicativi della freschezza del pesce. Lipoxantina è una base purinica proveniente dal catabolismo degli acidi nucleici; inoltre costituisce il prodotto di degradazione dellATP muscolare, fenomeno la cui entità è proporzionale alla freschezza del pesce Il metodo è nuovamente colorimetrico: si misura lassorbanza a 280 nm dellacido urico generatosi per via enzimatica dallipoxantina a pH 8.2 in presenza di xantinaossidasi xantinaossidasi Indice di ipoxantina

42 Anche questo test è indicativo della freschezza del pesce. Le basi volatili sono le ammine lineari TMA e DMA, tipiche dei pesci marini, e lammoniaca, principale base nei pesci di acqua dolce. Globalmente sono indicate come TVB, Total Volatile Bases La determinazione si effettua per titolazione acido- base. Le basi sono estratte dal campione di pesce con acido perclorico; lestratto è neutralizzato e sottoposto a distillazione, raccogliendo il distillato su una soluzione acida a titolo noto il cui eccesso si determina per titolazione con base Determinazione delle basi volatili

43 La trimetilammina è il principale indicatore di freschezza nei pesci marini. Importante è il rapporto TMAO/TMA in quanto il tenore di TMAO varia molto da specie a specie Determinazione della TMA Per la determinazione del TMA e del TMAO (previa riduzione a TMA) ci sono alcuni metodi; il principale è il dosaggio colorimetrico dopo reazione con acido picrico: si misura lassorbanza a 420 nm del picrato di trimetilammina, giallo

44 Il profilo elettroforetico delle proteine presenti in un campione può mettere in evidenza leventuale frode commerciale o la presenza di sostanze tossiche in un prodotto ittico. Lanalisi prevede lestrazione di un concentrato proteico da una frazione muscolare del campione, dal quale si elimina la frazione lipidica. La determinazione può essere effettuata anche sulle proteine sarcoplasmatiche, solubili in acqua: in questo caso è sufficiente mettere a contatto il campione macinato con una soluzione acquosa. Lanalisi è effettua con la tecnica CZE In Identificazione di diverse specie ittiche In questo esempio sono mostrati i tracciati relativi alle proteine solubili di alcune specie di pesci piatti quali platessa, rombo e sogliola. La figura mostra lelettroferogramma di una miscela standard (Cyt, citocromo; Lys, lisozima; Alb, albumina; Conalb: conalbumina)

45 Rombo Sogliola Platessa europea Platessa americana

46 I prodotti ittici vanno incontro più di altri alimenti allo sviluppo di microorganismi e quindi possono costituire un veicolo di malattie infettive, parassitosi, intossicazioni. Nel controllo dei prodotti ittici è quindi molto importante la conoscenza dellambiente da cui proviene il pescato, in quanto prodotti anche in ottimo stato di salute possono trasmettere sostanze tossiche o microorganismi patogeni per luomo. La presenza di sostanze tossiche può avere diverse origini: Sostanze tossiche nei prodotti ittici attività microbica attività microbica produzione endogena di biotossine (pesci velenosi) produzione endogena di biotossine (pesci velenosi) contaminazioni ambientali, in particolare da mercurio contaminazioni ambientali, in particolare da mercurio

47 I primi due gruppi si possono riassumere globalmente nei seguenti casi: Tossine da avvelenamento sgombroide (istamina) Tossine da avvelenamento sgombroide (istamina) Avvelenamento Ciguatera Avvelenamento Ciguatera Tossine da molluschi (ASP, DSP, NSP, PSP) Tossine da molluschi (ASP, DSP, NSP, PSP) Tetrodotossina Tetrodotossina Gempilotossina Gempilotossina Pfiesteria Pfiesteria

48 Le sostanze prodotte da attività microbica possono essere: tossine microbiche vere e proprie, come quella prodotta dal Clostridium botulinum tipo E, uno dei pochi germi patogeni della flora indigena dei pesci; esso può risultare presente anche in pesci che vivono in zone incontaminate, ma fortunatamente la tossina è distrutta con la cottura; un altro esempio è la tossina stafilococcica, prodotta dallo Stafilococcus aureus che fa parte della flora accidentale del pesce: si tratta di un composto più termostabile; infine, lesotossina termolabile di natura proteica prodotta dal Vibrio colerae, responsabile dellepidemia di colera del 1973 a Napoli tossine microbiche vere e proprie, come quella prodotta dal Clostridium botulinum tipo E, uno dei pochi germi patogeni della flora indigena dei pesci; esso può risultare presente anche in pesci che vivono in zone incontaminate, ma fortunatamente la tossina è distrutta con la cottura; un altro esempio è la tossina stafilococcica, prodotta dallo Stafilococcus aureus che fa parte della flora accidentale del pesce: si tratta di un composto più termostabile; infine, lesotossina termolabile di natura proteica prodotta dal Vibrio colerae, responsabile dellepidemia di colera del 1973 a Napoli composti che si formano durante i processi di alterazione: molti casi di intossicazione in seguito a consumo di pesce sono stati attribuiti alla presenza di istamina formatasi a partire dallistidina composti che si formano durante i processi di alterazione: molti casi di intossicazione in seguito a consumo di pesce sono stati attribuiti alla presenza di istamina formatasi a partire dallistidina

49 Listamina proviene dalla decarbossilazione dellistidina: Numerose specie batteriche contengono lenzima decarbossilasi, tra cui Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Clostridium perfrigens, Vibrio spp e soprattutto Morganella morganii Livelli tossici di istamina si possono trovare solo nei pesci a carne rossa, che contengono elevate quantità di istidina libera, e non, in quelli a carne bianca e in crostacei e molluschi. Il limite di legge è 100 mg/Kg. Da notare che lingestione di 70–1000 mg per singolo pasto può condurre al cosiddetto avvelenamento sgombroide che in soggetti particolarmente sensibili porta alla morte L-istidin-decarbossilasi - CO 2

50 La determinazione dellistamina si può effettuare per HPLC, per IC o per CZE, sfruttando il suo comportamento basico. Lanalita è estratto dal campione di pesce con una soluzione acida (HCl o HClO 4 ) Nella figura sono mostrati il cromatogramma ottenuto con HPLC (sopra) e lelettroferogramma (sotto) di un campione di tonno addizionato con istamina (picco 1) e lo standard interno 1,1-dimetilbiguanide (picco 2); in entrambi i casi il rivelatore è un DAD, cioè un Diode Array Detector

51 Essendo una base, listamina si può anche separare per cromatografia ionica. Lestrazione dal campione di pesce avviene sempre con una soluzione acida; gli eventuali grassi presenti sono eliminati per controestrazione con esano e per passaggio su colonnina RP-C18 La separazione avviene su colonna a scambio cationico ed eluente acido perclorico. Un reattivo post-colonna contenente NaOH favorisce la rivelazione in amperometria pulsata con elettrodo di oro picco 1: istamina in un campione di tonno

52 Oltre allistamina e alla già citata TMA, è utile verificare la presenza nel pesce di altre ammine biogeniche. In condizioni di stoccaggio non corretto, esse si possono formare a seguito di disponibilità di amminoacidi liberi in presenza di batteri capaci di operare la decarbossilazione. Le più importanti ammine biogeniche nei prodotti ittici sono cadaverina, putrescina, spermidina, spermina, agmatina (alifatiche), tiramina (alicicliche), istamina e triptammina (eterocicliche). La loro presenza è un indice di deterioramento dovuto ad attività batterica La determinazione delle ammine biogene si può effettuare con HPLC, con IC oppure, in maniera più semplice, con TLC. Lestrazione dal campione può avvenire con una soluzione di Cadaverina Putrescina acido tricloroacetico; in seguito lestratto è trattato con cloruro di dansile per trasformare le ammine in una forma più adatta alla separazione Per la separazione in TLC (sx) si usa una lastrina di gel di silice e una miscela eluente cloroformio/dietil etere/trietilammina 6:4:1; la rivelazione è fluorimetrica

53 La determinazione delle ammine biogene con IC, anche se richiede una strumentazione più costosa della TLC, è relativamente pratica. La procedura è analoga a quanto descritto per listamina: estrazione dal campione in ambiente acido, purificazione con RP-C18, separazione in scmbio cationico e rivelazione amperometrica in ambiente basico

54 Per quanto riguarda le sostanze tossiche di natura endogena, va detto che nel Mediterraneo non sono presenti specie ittiche velenose. Unica eccezione è rappresentata dai pesci anguilliformi (murena, grongo, anguilla) che contengono una tossina termolabile, inattivata in fase di cottura Tra i pesci esotici, invece, esistono molte verietà velenose: il pesce palla, una vera prelibatezza per i Giapponesi, può risultare fatale per il consumatore se non è preparato adeguatamente. Nel 1977 in Italia, ci furono diversi casi di intossicazioni, di cui uno mortale, a causa di alcune code di pesce palla erroneamente inserite all'interno di una partita di rane pescatrici decapitate o code di rospo; i due pesci, decapitati ed eviscerati, possono essere confusi Coda di rospo Pesce palla

55 La tossina prodotta dal pesce palla e dai tetraodontidi (ordine a cui esso appartiene) è una potente neurotossina termostabile: la tetraodotossina o TTX (dx). Lazione di questa tossina si esercita sul sistema nervoso, bloccando la conduzione degli impulsi nervosi e provocando la paralisi; lavvelenamento è noto come Puffer Fish Poisoning o PFP. Una dose di 1- 2 mg è già letale per luomo Unaltra neurotossina che provoca effetti analoghi è la saxitossina (sx), contraibile attraverso lassunzione di molluschi lamellibranchi. Si tratta di un alcaloide termostabile che causa unintossicazione spesso mortale, nota come Paralytic Shellfish Poisoning (PSP), un esempio delle sindromi causate da molluschi bivalvi per azione delle cosiddette shellfish toxins. Mitili, ostriche e altri bivalvi si nutrono di alghe dinoflagellate velenose senza morire e così facendo trasmettono il veleno al consumatore. Altri tipi di avvelenamento sono noti come Diarrhetic (DSP), Neurotoxic (NSP) e Amnesic Shellfish Poisoning (ASP), dagli effetti facilmente intuibili Un altro tipo di intossicazione è la ciguatera, causata da pesci che vivono lungo le barriere coralline. Le tossine sono prodotte da organismi bentonici ed entrano nella catena alimentare fino ai pesci, rendendoli tossici per vari anni

56 Le tossine endogene descritte sono di natura complessa; la loro determinazione quali- e quantitativa richiede metodi efficaci di pretrattamento e di separazione. In più le TTXs non hanno gruppi cromofori, quindi non si può impiegare la classica rivelazione UV-visibile. È possibile sfruttarne il comportamento acido/base per ottenere le condizioni adatte di estrazione ed eluizione In questo esempio unaliquota di pesce Fugu pardalis (un tetraodontide comune nei mari del Giappone) è estratta a caldo con acido acetico diluito; lestratto è filtrato, purificato per passaggio su resina a fase inversa e poi per estrazione con CHCl 3. La soluzione residua è analizzata con IIC (Ion Interaction Chromatography) con rivelazione fluorimetrica. Usando fasi mobili leggermente diverse è possibile separare le TTXs (sx) e le saxitossine (dx) in vari organi del pesce in esame

57 In questo esempio è impiegata la tecnica CZE per la separazione di tossine ASP (acido domoico) e PSP da molluschi prelevati in Galizia. Lestrazione dal campione di tessuto omogeneizzato si effettua con miscela acqua/metanolo 1:1. Per la determinazione delle tossine ASP, lestratto è purificato passandolo prima su resina a scambio anionico, da cui gli analiti sono desorbiti con acido formico, e poi su resina a scambio cationico da cui gli analiti sono desorbiti con sodio tetraborato/acetonitrile; la separazione CZE (sx) è effettuata su capillare di silice e la rivelazione è spettrofotometrica a 242 nm. Per le tossine PSP, lestratto è purificato su resina C18 e filtrato; la separazione CZE (dx) è effettuata su capillare PVA e rivelazione UV a 200 nm

58 A differenza della carne, nel pesce la contaminazione da metalli pesanti rappresenta un aspetto da non sottovalutare. Innanzitutto lambiente in cui si sviluppano i pesci, marino, lacustre o fluviale che sia, può essere considerato una soluzione più o meno diluita di ioni metallici con cui i pesci stessi possono interagire. Alcuni organismi acquatici, inoltre, hanno spiccata tendenza a preconcentrare ioni metallici come mercurio e piombo; in casi particolarmente sfavorevoli (es. Minamata) gli organismi possono modificare la forma chimica degli ioni assorbiti, secondo reazioni di biotrasformazione (in questo caso biometilazione) Hg 2+ CH 3 Hg + in cui la forma risultante è notevolmente più tossica, per luomo, rispetto a quella originaria in quanto si tratta di un composto che può penetrare attraverso le membrane cellulari e accumularsi nellorganismo, a differenza della specie inorganica Per questo motivo è molto importante conoscere lambiente da cui proviene il pesce pescato Metalli pesanti nel pesce

59 Il contenuto di mercurio nei prodotti ittici rappresenta un caso di particolare rilevanza, in quanto il pesce (soprattutto predatori di grossa taglia come tonno, pesce spada, palombo, anguilla, luccio, ecc.) è la fonte principale, sebbene indesiderata, di questo metallo nella nostra dieta Il mercurio

60 La tossicità del mercurio è nota da secoli Limpiego di sali si mercurio nella lavorazione del pellame per la fabbricazione di cappelli di feltro causava danni al sistema nervoso, come è testimoniato dal bizzarro comportamento del Cappellaio Matto in Alice nel Paese delle Meraviglie

61 Nelle acque la concentrazione di Hg totale si aggira attorno alle decine di ng/l (a parte casi particolari, es. Priolo 2001 con concentrazioni superiori alla norma). Il mercurio presente nell'acqua viene ingerito dal plancton e risale via via la catena alimentare, diventando sempre più concentrato. È il cosiddetto fenomeno del bioaccumulo. I pesci che sono al vertice della piramide alimentare arrivano ad avere una concentrazione da a volte maggiore di quella dell'acqua in cui vivono; nelle ostriche si arriva a volte Il mercurio nel mare I pesci più contaminati contengono ppm di Hg. In acque molto contaminate (es. Reno in Germania) il contenuto può arrivare a 2 ppm. Allapice della catena alimentare si può arrivare a 20 ppm. Nell'uomo si ha un'ulteriore concentrazione e quando Hg nel cervello supera certi valori, sopraggiungono i problemi neurologici

62 Per la determinazione del mercurio totale le tecniche più sensibili sono la spettroscopia di fluorescenza atomica (AFS) e la spettroscopia di assorbimento atomico. In entrambi i casi la sensibilità può essere fortemente incrementata con il sistema detto a vapori freddi o cold vapour (CV-AFS e CV-AAS). Si tratta di trasformare il mercurio presente come ione Hg 2+ in mercurio elementare Hg 0, per mezzo di una riduzione in situ con agenti riducenti quali SnCl 2 o NaBH 4 ; la specie Hg 0 è poi istantaneamente volatilizzata (da cui il termine vapori freddi) e atomizzata da un flusso di azoto o aria e portata alla cella di determinazione Hg 2+ + Sn II Cl 2 Hg 0 + Sn IV Cl 2 Per abbassare i limiti di rivelabilità, nel percorso precedente alla cella è possibile inserire una trappola di oro che funga da preconcentratore, dal quale il mercurio trattenuto è rilasciato per desorbimento termico. Il lod di Hg può scendere fino a frazioni di ppt (ng/l)

63 La determinazione con le tecniche di spettroscopia atomica si effettua per via umida, il che richiede la solubilizzazione del campione o per lo meno dellanalita, con problemi notevoli di contaminazione; non è consigliabile, per esempio, effettuare le analisi in un laboratorio in cui si svolgono analisi polarografiche o voltammetriche. Generalmente è bene lavare la vetreria con HNO 3 prima di procedere al trattamento del campione La determinazione del mercurio nel pesce si effettua estraendo lanalita con una miscela acida. Il campione deve essere omogeneizzato ed essiccato a bassa temperatura per evitare perdite di analita: il mercurio elementare, che è liquido a temperatura ambiente, può passare in fase vapore già a 100°C, per cui il trattamento del campione da analizzare è un passaggio estremamente critico. Essiccamento prolungato a bassa temperatura (< 60°C) o liofilizzazione sono da preferire per avere un campione secco da cui partire; sul secco si può effettuare una digestione acida con HNO 3 coadiuvata da H 2 O 2 per liberare lanalita dagli eventuali gruppi complessanti presenti nelle macromolecole (es. gruppi tiolici negli amminoacidi metionina, cistina e cisteina). La digestione è più efficiente se effettuata in forno a microonde in bomba di teflon Questa procedura porta naturalmente alla determinazione del mercurio totale, in quanto le eventuali forme di mercurio organico sono degradate a mercurio inorganico HNO 3 HNO 3 Hg 2+, C x H y Hg n+ Hg 2+

64 ione mercurio Hg 2+ e relativi sali ione mercurio Hg 2+ e relativi sali vapori di mercurio elementale Hg 0 vapori di mercurio elementale Hg 0 composti di organomercurio, es. CH 3 HgCl, CH 3 CH 2 HgCl, (CH 3 ) 2 Hg composti di organomercurio, es. CH 3 HgCl, CH 3 CH 2 HgCl, (CH 3 ) 2 Hg La tossicità del mercurio varia notevolmente a seconda della sua forma chimico-fisica. Essa si incrementa nella serie:

65 LUE ha stabilito un limite massimo di 0.5 mg/Kg nelle parti commestibili di pesci e molluschi (peso umido), ma nessun limite è stato indicato per forme di organomercurio, forse per la difficoltà di applicare sistematicamente le procedure analitiche di speciazione In effetti la speciazione, cioè la determinazione delle varie forme chimico-fisiche in cui un elemento può essere presente, è un compito estremamente complesso, sia perché i composti possono essere instabili o altamente reattivi, sia perché le concentrazioni in gioco sono spesso al di sotto delle capacità delle tecniche analitiche convenzionali. In definitiva, per eseguire uno studio di speciazione è necessario rivolgersi alle tecniche accoppiate o ifenate (dallinglese hyphen che indica il trattino di sillabazione) nelle quali un sistema cromatografico è interfacciato, o, appunto, ifenato, ad un sistema di rivelazione spettroscopica che funge da rivelatore non convenzionale

66 Questa combinazione sfrutta i vantaggi di entrambi i sistemi: la parte cromatografica produce frazioni pure di analita la parte cromatografica produce frazioni pure di analita la parte spettrale fornisce informazioni su un componente puro la parte spettrale fornisce informazioni su un componente puro

67 Le tecniche ifenate più comuni sono GC-MS ed LC-MS, disponibili in versioni commerciali largamente diffuse. Altre tecniche sono meno diffuse, es. GC- ICP/MS (sotto), LC- ICP/MS

68 Nel caso del mercurio, le tecniche di speciazione devono fare i conti con un elemento presente in concentrazioni solitamente e fortunatamente basse, e con forme chimiche alquanto volatili. Mentre la separazione delle varie forme non è un problema dal punto di vista cromatografico (si può effettuare in GC, in HPLC e in IC), può esserlo limpiego dei rivelatori convenzionali per cromatografia che non hanno la necessaria sensibilità. Attualmente, però, è possibile impiegare i sistemi ifenati (es. GC-ICP- AES, sotto) In particolare il sistema CV costituisce il miglior sistema di rivelazione in interfacciamento a sistemi cromatografici

69 Schema di un sistema HPLC-CV-AAS 1Serbatoio di eluente 2Modulo cromatografico 3Valvola diniezione 4Colonnina di preconcentrazione 5Colonna cromatografica 6Giunzione a T 7Pompa per HPLC 8Serbatoio di NaBH 4 9Cella a flusso 10Gas di trasporto (N 2 ) 11Flussimetro 12,13Setti porosi di vetro 14Trappola di Mg(ClO 4 ) 2 15Rivelatore CV-AAS 16Registratore

70 per trattamento con composti solforati, come la tiourea e la cisteina (dx), i cui gruppi =S ed –SH sono in grado di estrarre tutti i composti di mercurio presenti nel campione per trattamento con composti solforati, come la tiourea e la cisteina (dx), i cui gruppi =S ed –SH sono in grado di estrarre tutti i composti di mercurio presenti nel campione per conversione dei composti di mercurio nei corrispondenti alogenuri ed estrazione in solvente organico; eventualmente si effettua una controestrazione in soluzione acquosa di cisteina se la tecnica cromatografica non è compatibile con solventi organici (es. IC) per conversione dei composti di mercurio nei corrispondenti alogenuri ed estrazione in solvente organico; eventualmente si effettua una controestrazione in soluzione acquosa di cisteina se la tecnica cromatografica non è compatibile con solventi organici (es. IC) Per applicare le tecniche di speciazione, che operano comunque per via umida, è necessario un pretrattamento che non alteri le forme chimiche presenti. Non è possibile quindi impiegare miscele ossidanti per solubilizzare il campione di pesce, in quanto ciò causerebbe la rottura del legame C-Hg La solubilizzazione si può eseguire in vari modi: Tiourea Cisteina

71 In questo esempio è mostrata lanalisi di un campione di tonno BCR, cioè il cui contenuto di Hg è certificato e pari a 3.52 ppm. Il campione omogeneizzato, liofilizzato ed estratto con soluzione di tiourea, è analizzato mediante HPLC in fase inversa trasformando tutte le specie presenti in complessi neutri con il chelante APDC (ammonio pirrolidin ditiocarbammato) 1)CH 3 Hg + 2)C 2 H 5 Hg + 3)Hg 2+ a)campione tal quale b)campione addizionato con CH 3 Hg +, C 2 H 5 Hg + e Hg 2+


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