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Sindromi talassemiche ed emoglobinopatie. AM-tbmadc 2 Definizione della patologia Assenza o ridotta sintesi di una o più catene globiniche umane Classificazione.

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1 Sindromi talassemiche ed emoglobinopatie

2 AM-tbmadc 2 Definizione della patologia Assenza o ridotta sintesi di una o più catene globiniche umane Classificazione clinica – gravità Classificazione genetica – tipo di catena Classificazione molecolare – tipo di mutazione

3 AM-tbmadc 3

4 4 Classificazione clinica Major (idrope fetale, -tal major) Intermedia ( -tal interm., HbH) Portatore ( e ) Portatore silente ( e )

5 AM-tbmadc 5 STRISCIO DI SANGUE PERIFERICO (colorazione May-Grunwald-Giemsa) Soggetto normale Portatore di -talassemia Nel portatore di -talassemia è rilevabile: aspetto ipocromico, aniso-micro-poichilocitosi delle emazie, presenza di schistociti, emazie a bersaglio, ed emazie a lacrima. I.Bianco Silvestroni, 1998

6 AM-tbmadc 6 -TALASSEMIA: alterazioni ematologiche

7 AM-tbmadc 7

8 8 -talassemia: alterazioni ematologiche

9 AM-tbmadc 9 -thal alleles (47) - (3.7) initiation cd ACCATG - - CATG 2 ATG ACG 1 ATG GTG 2 cd 29 T C (Agrinio) 2 IVS1 (-5nt) 2/ 1 cd 110 C A (Petah Tikva) 2 cd 142 T A (Icaria) 2 polyA ATAA ATGA -thal alleles (18) -thal alleles -65 A G -55 T C cd 4 C T cd 27 G T Corfù –7.2 Kb Hb Lepore -thal alleles Sicilian Spanish Turkish Macedonian HPFH Structural variants HbS HbC HbD Punjab HbO-Arab Heterogeneity of hemoglobinopathies in Mediterranean Hb Hasharon -( ) MED-I --MED-II -( ) (MA) --(CL) --(CAL) HPFH –4 HPFH – A C T -117 A G A Sardinian 5 - CT 8/9 + G 30 C 1-1 A 1-2 A 1-2 G 1-5 C 1-5 T A G C 39 T 37 A 44-C 54-T 59-A 7-C C G G A G C -90 T -88 A -88 T -87 G -87 T -87 A -86 A -31 C -30 A -30 C 6 - A 8 - AA 27 T 1-5 A 1-6 C 2-1 A AACAAA AATGAAA -101 T -92 T UTR +10-T + 33 G G AATAAG

10 AM-tbmadc 10 Cap Poly-A

11 AM-tbmadc 11 TATA box 2 enhancers a 600 – 900 bp a valle del gene +

12 AM-tbmadc 12

13 AM-tbmadc 13 Fattori di trascrizione del gene -globinico GATA-1 + FOG (GATA: 2 domini Zinc-finger) NF-E2(PLTs) EKLF(3 Zinc-finger; switch) Fattore stadio-specifico (SSP; stimola )

14 AM-tbmadc 14

15 AM-tbmadc 15

16 AM-tbmadc 16 RELATIVE FREQUENCIES OF -THALASSEMIA MUTATIONS IN WEST EUROPE Galanello et al, TIF 2003

17 AM-tbmadc 17 RELATIVE FREQUENCIES OF -THALASSEMIA MUTATIONS IN MEDITERRANEAN EUROPE Galanello et al, TIF 2003

18 AM-tbmadc 18

19 AM-tbmadc 19

20 AM-tbmadc 20

21 AM-tbmadc 21 Epidemiology of thalassemia: global estimate Carrier rate4.9% of world populat. Total carriers 300,000,000 Newborn carriers with Hb disorders 6.1% Newborns with a major Hb disorders2.1/1000 Affected births/year 307,000 (WHO 1998)

22 AM-tbmadc 22

23 AM-tbmadc 23 4 MCH, MCV 4 HbA 2, HbF 4 Assetto emoglobinico 4 Metabolismo del Ferro 4 Sintesi delle catene globiniche 4 Analisi dei geni globinici 4 Studi famigliari 4 MCH, MCV 4 HbA 2, HbF 4 Assetto emoglobinico 4 Metabolismo del Ferro 4 Sintesi delle catene globiniche 4 Analisi dei geni globinici 4 Studi famigliari Emoglobinopatie: test di laboratorio utili per lidentificazione del portatore talassemico

24 AM-tbmadc 24 Fenotipo classico del portatore di talassemia MCV, fL 67 ± 6 MCH, pg 22 ± 2 HbA 2, % 5 ± 1 Hb elettroforesi A + (F) + A 2 Rapporto > 1,20 MCV, fL 67 ± 6 MCH, pg 22 ± 2 HbA 2, % 5 ± 1 Hb elettroforesi A + (F) + A 2 Rapporto > 1,20

25 AM-tbmadc 25 Falsi positivi: - talassemia - a. sideropenica Falsi negativi: - interazione talassemia - deficit folati e B 12 Falsi positivi: - talassemia - a. sideropenica Falsi negativi: - interazione talassemia - deficit folati e B 12 Limiti nellutilizzo dei parametri eritrocitari (MCV, MCH) nella identificazione del portatore di talassemia

26 AM-tbmadc 26 MCV, fl76.0 MCH, pg26.0 HbA 2, %2.5 MCV, fl76.0 MCH, pg26.0 HbA 2, %2.5 MCV, fl72.2 MCH, pg23.3 HbA 2, %5.6 MCV, fl72.2 MCH, pg23.3 HbA 2, %5.6 MCV, fl83.2 MCH, pg28.1 HbA 2, %6.0 MCV, fl83.2 MCH, pg28.1 HbA 2, %6.0 Doppia eterozigosi per e talassemia

27 AM-tbmadc 27 Correlazione genotipo-fenotipo Fenotipo eterogeneo per: –Gravità della mutazione –Interazioni (,, ) talassemia e varianti emoglobiniche –Altre modificazioni genetiche ed ambientali

28 AM-tbmadc 28 HbA 2, % ND ND Effetti della co-ereditarietà di diversi alleli -talassemici sullo MCV in soggetti portatori di -talassemia MCV, fLHbA 2, % (R. Galanello, 2002)

29 AM-tbmadc 29 Varianti emoglobiniche e sindromi talassemiche Varianti emoglobiniche (2002)845 (erano 202 nel 1976) Mutazioni talassemiche336 (4,5 % eterozigoti = world-wide) Emoglobinopatie con fenotipo talassemico 43

30 AM-tbmadc 30 Microcitosi con HbA 2 normale HbF elevate HbA 2 borderline Microcitosi con HbA 2 normale HbF elevate HbA 2 borderline Problemi nello screening delle talassemie

31 AM-tbmadc 31 - condizioni acquisite (ipertiroidismo, anemia megaloblastica, terapia con farmaci anti-retrovirus) HbA 2, senza -talassemia HbA 2, in presenza di -talassemia - alleli talassemici silenti - interazione tra e talassemia - a. sideropenica grave - associazione tra -tal. ed una variante con mutazione sulle catene Limiti nellutilizzo della sola HbA 2 nella identificazione del portatore di talassemia

32 AM-tbmadc 32 Hemoglobin and HbA 2 in non- and -thalassemia trait with iron deficiency non -thal trait Galanello et al., 1981

33 AM-tbmadc non silent IVS C G mild severe HbA 2 (%) C T Livelli di HbA 2 in diversi tipi di mutazioni -talassemiche IVS1-6 T C ° 39 C T (R. Galanello, 2002)

34 AM-tbmadc 34 Interazione e talassemia MCV, fl 77 MCH, pg 25 HbA 2, % 1.6 Family F.F ratio 1.92 MCV, fl 67 MCH, pg 21 HbA 2, % cd 27 G T ° cd 6(-A)

35 AM-tbmadc 35 - Hb F 9 – 20 %, sintesi catene 1,6 – 2,4 delezione HPFH -HbF 3-4 % (scarso significato) -HbF % sintesi catene normale HbF elevate

36 AM-tbmadc 36 Cause di aumento dellHbF Genetiche Acquisite - talassemia HPFH anemia congenita ipoplastica - talassemia HPFH anemia congenita ipoplastica Espansione eritropoietica trapianto di midollo emolisi acuta gravidanza Associata con tumori ematopoietici leucemia juvenile cronica mielogena altri disordini mieloproliferativi sindromi preleucemiche Farmacologica 5-Aza HU Epo Butirrati Altri grassi a catena corta Espansione eritropoietica trapianto di midollo emolisi acuta gravidanza Associata con tumori ematopoietici leucemia juvenile cronica mielogena altri disordini mieloproliferativi sindromi preleucemiche Farmacologica 5-Aza HU Epo Butirrati Altri grassi a catena corta

37 AM-tbmadc 37 WT 39 IVSI nt IVSI nt 1 IVSI nt 110 IVSII nt IVSII Analisi con DHPLC di soggetti eterozigoti per mutazioni del gene beta e delta

38 AM-tbmadc 38 Terapia molecolare Terapia genica farmacologica (gene –idrossiurea –acido butirrico Trapianto genico (terapia genica somatica) –trasfezione gene -globinico normale vettore retrovirale –murine leukemia –Lentivirus Manipolazione dello switch

39 AM-tbmadc 39 Danno ossidativo HbO 2 MetHb Globine o Emicromi corpi di inclusione legame alle membrane degradazione eme ROS perossidazione lipida + GSH + MDA + esposizione PS emolisi Antiossidanti: vit E, flavonoidi, polifenoli

40 AM-tbmadc 40 Pathways coinvolte nel danno alle membrane degli eritrociti in α e β talassemia Weatherall DJ, 1998

41 AM-tbmadc 41 Prodotti di degradazione delle catene globiniche: Globina Eme Emina (forma ossidata delleme) Fe libero FORMAZIONE DI ROS (reactive oxygen species)

42 AM-tbmadc 42 ROS (reactive oxygen species) Danni a organelli intracellulari, proteine (banda 4.1) e lipidi di membrana Gutteridge JMC, 1995

43 AM-tbmadc 43 Meccanismi di perossidazione lipidica Gutteridge JMC, 1995

44 AM-tbmadc 44 In pazienti affetti da talassemia si riscontra un aumento significativo di TBARS e CD, markers di perossidazione lipidica… Meral A et al. 2000

45 AM-tbmadc 45

46 AM-tbmadc 46 CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DELLE EMOGLOBINOPATIE (1/2) Anormalità Luogo Sintomatol. Esempio funzionale sostituzione ) Nessuna Sup. esterna Nessuna Hb G Philadelphia 68 Asn ->Lys 2) Aggregazione Sup. esterna Anemia emol. Hb S ridotta solub. (omozigote) 6 Glu ->Val 3) Instabilità Eme/ Anemia emol. Hb Bristol ridotta solub. contatti subun. 67 Val ->Asp 4) Met Hb His prox./dis. Cianosi Hb M Hyde Park 92 His -> Tyr

47 AM-tbmadc 47 CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DELLE EMOGLOBINOPATIE (2/2) Anormalità Luogo Sintomatol. Esempio funzionale sostituzione ) Aumentata Contatto 1 2 Eritrocitosi Hb Chesapeake affinità O 2 C-terminale 92 Arg -> Leu 6) Diminuita Eme/ 1 2 Cianosi Hb Kansas affinità O Asn ->Thr 7) Ridotta produz. Mutazione Fenotipo Hb Constant catene C-terminale talassemico Spring ( +31) 8) Ridotta prod. Ibrido di fusione Fenotipo Hb Lepore catene talassemico

48 AM-tbmadc 48 Drepanocitosi (anemia falciforme)

49 AM-tbmadc 49 Fenotipo anemia falciforme (anemia emolitica cronica + crisi vaso-occlusive) Periostite metacarpale piede-mano Osteonecrosi della testa del femore Infarto cerebrale Sindrome acuta-toracica Retinopatie Epatopatie Ipostenuria da lesione midollare renale Ulcere malleolari Sequestrazione splenica Infezioni gravi da germi capsulati (pneumococco)

50 AM-tbmadc 50 Correlazione genotipo-fenotipo nellanemia falciforme Genotipo al locus HbS/HbC HbS/ -talassemia Geni modificatori HbF (cromosoma X e 6) Aplotipi -globinici Benin, Senegal, Bantù, Centro-Africa, Arabo-Indiano Polimorfismo C->T in -158 gG (HbF più elevata) -talassemia


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