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Diffrazione Schema generale della camera di flusso di un citometro ottico.

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Presentazione sul tema: "Diffrazione Schema generale della camera di flusso di un citometro ottico."— Transcript della presentazione:

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2 Diffrazione Schema generale della camera di flusso di un citometro ottico

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4 PLT RBC Sistemi ad Impedenza e Globuli Rossi Sistemi ad Impedenza e Globuli Rossi

5 Emocromo: Terminologia WBC. White Blood Cells, Globuli Bianchi (GB). Indica il numero di GB per mL o L di sangue. RBC. Red Blood Cells o Globuli Rossi (GR). È il numero di GR per mL o L di sangue. Hb. Hemoglobin o emoglobina Esprime la quantità (espressa in grammi) di Hb presente in un L o dL di sangue. Ht. Hematocrit (ematocrito). Reticolociti. G.R. neoformati

6 Emocromo: Terminologia INDICI MCV, Mean Corpuscular Volume, (Volume Corpuscolare Medio). Indica il volume medio dei globuli rossi. I GR normali sono, per quanto riguarda il volume, normocitici. Se il volume diminuisce, come nelle talassemie o nell'anemia da carenza di ferro, i GR sono definiti microcitici; se aumenta (p.e. nelle anemie da carenza di vitamina B12) si avrà una macrocitosi delle emazie. MCH, Mean Corpuscolar Hemoglobin. Indica la quantità media di emoglobina in ogni globulo rosso. MCHC, Mean corpuscolar Hemoglobin Concentration o Concentrazione Emoglobinica Corpuscolare Media. Indica la concentrazione media di emoglobina all'interno del singolo globulo rosso. MPV, Mean platelet Volume o Volume Piastrinico Medio. Indica il volume medio delle piastrine.

7 Emocromo: Terminologia Anisocitosi. notevole variazione nelle dimensioni dei globuli rossi o delle piastrine. Se di entità importante sono segnalate con una scala numerica (1+, 2+ ecc.) Se le dimensioni dei GR diminuiscono o aumentano avremo una microcitosi o una macrocitosi delle emazie, Lo stesso per le piastrine. Poichilocitosi. Variazione della forma del contorno dei G.R. Forma a falce: drepanociti (anemia falciforme); di cellula a bersaglio o codocita (talassemie ed altre anemie); sferica o sferociti (sferocitosi ereditaria); di ellissi (ellissicitosi o ovalocitosi ereditaria); di frammenti globulari o schizociti Aggregati piastrinici. Indica la presenza di ammassi piastrine che appaiono riunite assieme, invece di essere separate, come di norma. In genere è un artefatto di laboratorio e non ha nessun significato clinico.

8 Stabilità nel tempo dei parametri ematologici CITOMETRIA A FLUSSO

9 RBC HGB HTC MCV MCH MCHC RDW

10 120 fL 60 fL RDW MCV Anisocitosi Fisiologica CHCM HDW 28 g/dL41 g/dL Anisocromia Fisiologica

11 RDW Normale < 15,5% RDW Elevato 18 % RDW Molto Elevato 35 % RDW (Red Distribution Width) È un valore statistico corrispondente alla DS o al CV della distribuzione dei Globuli Rossi. Equivale all Indice di Anisocitosi

12 How Useful Are RBC and Reticulocyte Reports to Clinicians? Am J Clin Pathol 118(5): , 2002 PARAMETRI PIU FREQUENTEMENTE USATI RBC HB HT MCV MCH MCHC ret ico loc iti

13 Ematocrito o PCV (Packed Cells Volume) o HCT (HematoCriT) Valori ematici normali nell'uomo: 42% - 51% Valori ematici normali nella donna: 37% - 47% rappresenta il volume percentuale della frazione corpuscolata del sangue rispetto al volume totale del sangue. Metodo di determinazione Manuale Il sangue venoso reso incoagulabile (per aggiunta di una soluzione di ossalato di calcio ed ossalato di potassio in rapporto 3:2 e con concentrazione finale di 2 mg per ml di sangue) si centrifuga nella provetta ematocrito di Wintrobe a 1500 giri per 30 minuti. In condizioni normali la frazione corpuscolata occupa circa il 45% del volume totale di sangue.

14 How Useful Are RBC and Reticulocyte Reports to Clinicians? Am J Clin Pathol 118(5): , 2002 PARAMETRI PIU FREQUENTEMENTE USATI RBC HB HT MCV MCH MCHC ret ico loc iti

15 Variazioni dellemoglobina Increased Hemoglobin (Increased Red Blood Cell Count ) Polycythemia Vera Vigorous Exercise High altitude Tobacco Abuse Renal cell carcinoma Cardiovascular disease Stress Dehydration Decreased Hemoglobin (decreased Red Blood Cell Count ) Anemia

16 Anemia Classificazione fisiopatologica Ridotta produzione di eritrociti Aplasia midollare Infiltrazione neoplastica del midollo osseo Carenza di vitamina B12 e/o di folati Sindromi mielodisplastiche Anemia da IRC Sintesi emoglobinica anomala o ridotta Anemia sideropenica Anemia da disordini cronici(infiammazioni, infezioni, neoplasie) Sindromi talassemiche Emoglobine abnormi Anemia associata a endocrinopatie Aumentata distruzione eritrocitaria Anemie emolitiche Da causa intracorpuscolare Alterazioni della membrana eritrocitaria Alterazioni della glicolisi anaerobia Deficit enzimatici dello shunt degli esosomonofosfati Alterazioni qualitative dellemoglobina Da cause extracorpuscolare Cause meccaniche Malattie emolitiche isoimmuni e autoimmuni

17 Anemia Classificazione di laboratorio Anemia microcitica/ipocromica (MCV<79fl, MCHC<32%) Diagnosi differenziale fra anemia sideropenica e trait talassemico Anemia normocitica/normocromica (8094 fl, 32%

18 High angle detector 5°-15° LUCE RIFRATTA Concentrazione Hb High angle detector 5°-15° LUCE RIFRATTA Concentrazione Hb Low angle detector 2°-3° SCATTER Volume RBC Low angle detector 2°-3° SCATTER Volume RBC sfericizzazione

19 VOLUME Densità (concentrazione Hb)

20 VOLUME

21 HC 41 HC 41 V > (4.7%) 6256 (31.1%) 9 (0.0%) V (15.3%) 7553 (37.6%) 64 (0.3%) V < (4.6%) 1221 (6.1%) 40 (0.2%) Macrociticheipocromiche Macrocitichenormocromiche Macrociticheipercomiche Normociticheipercromiche Microciticheipercrimche Microcitichenormocromiche Microciticheipocromiche Normociticheipocromiche Normocitichenormocromiche

22 Lanemia non è un innocent bystander, ma impatta decisamente sulla mortalità e morbilità ed il suo trattamento ha effetti benefici evidenti. Nissenson et al. Arch Inter Med 2003; 163: Lanemia è un fattore di rischio indipendente nello scompenso cardiaco cronico e per ogni 1% di HcT in meno vi è un aumento della mortalità del 1.6%. In unampia coorte di pazienti in istituti di ricovero con insufficienza cardiaca, lanemia è un fattore prognostico indipendente di mortalità Justin A. Ezekowitz et al. Circulation. 2003;107:223 Lanemia è associata con sintomi più gravi, maggior insufficianza funzionale e un significativo aumento della mortalità in pazienti con insufficienza cardiaca avanzata Horwich, T. B et al. JACC 39:

23 Blood transfusion is associated with a lower short-term mortality rate among elderly patients with acute myocardial infarction if the hematocrit on admission is 30.0 percent or lower and may be effective in patients with a hematocrit as high as 33.0 percent on admission. Wu W-C et al.NEJM 345: , 2001 In older women with disabilities, a haemoglobin (Hb) concentration of 14,0 g/dL was associated with a lower risk of all cause mortality than concentrations of 11,0 g/dL and 12,0 g/dL after adjustment for chronic disease burden. Mortality risk decreased with increasing Hb concentrations up to a threshold of 13,9 g/dL. Chaves PH et al Evidence-Based Medicine 2005; 10:90-97 Lanemia (HcT < 35%) è un fattore indipendente di morte in interventi di chirurgia generale Nei dializzati un HcT fra 33 e 39 abbatte del 16% la possibilità di ospedalizzazione ed è associato ad un basso rischio di morte

24 Definizione di Anemia della WHO Hemoglobin < 13g/dL for men and < 12 g/dL for women SourceMen g/dLWomen g/dL WHO13,012,0 Jandl14,212,2 Beutler14,012,3 Lee13,211,6 Rapaport14,012,0 Goyette13,211,7 Tietz13,211,7 Hoffman13,512,0

25 … e nei neonati e nei bambini ? … e nelle gravide? … e negli anziani?

26 Emoglobina I. Normal Values per age (-2 to +2 S.D) A. Birth: 13.5 to 24.0 g/dl (mean 16.5 g/dl) B. Age <1 month: 10.0 to 20.0 g/dl (mean 13.9 g/dl) C. Age 1-2 months: 10.0 to 18.0 g/dl (mean 11.2 g/dl) D. Age 2-6 months: 9.5 to 14.0 g/dl (mean 12.6 g/dl) E. Age 0.5 to 2 years: 10.5 to 13.5 g/dl (mean 12.0 g/dl) F. Age 2 to 6 years: 11.5 to 13.5 g/dl (mean 12.5 g/dl) G. Age 6-12 years: 11.5 to 15.5 g/dl (mean 13.5) H. Female 1. Age years: 12.0 to 16.0 g/dl (mean 14.0 g/dl) 2. Age >18 years: 12.1 to 15.1 g/dl (mean 14.0 g/dl) A. Male 1. Age years: 13.0 to 16.0 g/dl (mean 14.5 g/dl) 2. Age >18 years: 13.6 to 17.7 g/dl (mean 15.5 g/dl)

27 Variazioni dellemoglobina Anemia Cut-offs Men 1. Age years: <12.5 g/dl (CDC) 2. Age years: <13.3 g/dl (CDC) 3. Age >17 years: <13 g/dl (WHO) or <13.5 g/dl (CDC) Women (Non-pregnant, non- lactating) 1. Age years: <11.8 g/dl 2. Age years: <12.0 g/dl 3. Age >17 years: <12 g/dl (WHO and CDC) Women in Pregnancy (CDC Guidelines <5th percentile) 1. First Trimester: <11.0 g/dl 2. Second Trimester: <10.5 g/dl 3. Third Trimester: <11.0 g/dl Children (CDC Guidelines <5th percentile) 1. Age 1-2 years: <11.0 g/dl 2. Age 2-5 years: <11.1 g/dl 3. Age 5-8 years: <11.5 g/dl 4. Age 8-11 years: <11.9 g/dl

28 … e nelle persone di colore? GroupHemoglobin, g/dL White men, y White women, y Black men, y Black women, y

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30 Anemia sideropenica MCV < 80 fl (fase clinica) Hb correla con MCV e RBC Ipocromia e anisopoichilocitosi Ferritina, transferrina sideremia Recettori solubili per la transferrina Reticociti Ridotta Hb reticolocitaria RDW

31 STADI DI CARENZA MARZIALE Fe deposito Fe trasporto NORMALE DEPLEZIONE DEPOSITI ERITROPOIESI CARENTE Ipocro.Mi croc.NNN Eritrociti <10<15>20>20 Saturazione Transferrina (%) NN Transferrina (mg/dl) NN Sideremia (ng/ml) N Ferritina (ng/ml) Fe eritrocitario ANEMIA

32 Emoglobinopatie e Talassemie Anomalie del tetramero dellemoglobina Anomalie strutturali delle catene dellemoglobine (EMOGLOBINOPATIE) Riduzione o completa mancanza della sintesi di una o più catene polipeptidiche della molecola dellemoglobina (TALASSEMIE) N.B. 250 milioni di persone (4.5% della pop.mondiale) sono eterozigoti per un gene globinico difettivo ed annualmente nascono almeno 300 mila omozigoti affetti!!!

33 Beta talassemia Anemia mediterranea: (la beta-talassemia tipica dell'area mediterranea) trait talassemico un solo gene difettoso (condizione asintomatica) talassemia maior ambedue i geni difettosi (malattia grave) talassemia intermedia ambedue i geni difettosi (da lieve a grave)

34 Parametri nella Talassemia MCV RDW normale o Reticolociti normali o Ferritina normale o Transferrina normale Sideremia normale o Recettori solubili normali

35 Trait Talassemico MCV < 80 fl (eccetto aa/a- e b+) Hb non correla con MCV and RBC punteggiatura basofila delle cellule target studio delle catene globiniche HbA 2 RDW normale Screening per talassemia e emoglobinopatie

36 Diagnosi differenziale tra Anemia sideropenica e Trait Talassemico RBC

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38 Anemia in corso di malattia cronica MCV ridotto o normale MCH Sideremia, T.I.B.C. Ferritina normale o aumentata Recettori solubili per la transferrina normali Transferrina Anemia normo/microcitica

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40 Anemia macrocitica RDW aumentato in presenza di un valore MCV ai limiti superiori della norma, permette di individuare precocemente la presenza di: alcoolismo epatopatie carenza subclinica di B12/folati esposizione industriale a solventi organici mielodisplasia primitiva o chemioindotta assunzione terapeutica di AZT and HU

41 VOLUME Densità (concentrazione Hb) Deficitaria Sintesi del DNA Persistenza della Sintesi di RNA e delle Proteine

42 Bambina di 2 anni. Deficit di accrescimento Paziente di 70 anni P.S. Astenia Paziente di 77 anni P.S. Shock

43 Bambina di 2 anni. Deficit di accrescimento, irritabilità Anemia Megaloblastica Ret 0,8% MCVr 146

44 RBC HgB9.5 MCV106.9 MCHC33.1 PLT RBC HgB9.4 MCV95.5 MCHC31.7 PLT RBC HgB9.7 MCV84.1 MCHC31.7 PLT EFFETTO DELLA NORMALIZZAZIONE DEI LIVELLI DI VITAMINA B12

45 Sindromi Mielodisplastiche

46 Altre cause di macrocitosi, non megaloblastica Target cells Difetti di membrana Reticolocitosi

47 Rouleaux Agglutinati da Crioagglutinine Altre cause di macrocitosi, non megaloblastica

48 Paziente del P.S. anni 77 Shock Falsa macrocitosi e ipocromia da IPERGLICEMIA (da prelievo eseguito con glucosata in corso)

49 glucosio Situazioni di importante Iperglicemia glucosio Diluente dellanalizzatore Acqua glucosio Acqua

50 Ore Glicemia 1 gr Ore Glicemia 146 mg

51 Esame dirimente: Conta dei Reticolociti

52 La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive Eritroblasti Ortocromatici Eritroblasti Ortocromatici Reticolociti Midollari Tempo di Permanenza 2-3 giorni Reticolociti Midollari Tempo di Permanenza 2-3 giorni Barriera EMATO- MIDOLLARE Barriera EMATO- MIDOLLARE Reticolociti nel Sangue Periferico Tempo di permanenza giorni Reticolociti nel Sangue Periferico Tempo di permanenza giorni

53 I reticolociti sono globuli rossi in cui la colorazione sopravitale a fresco con alcuni coloranti basici mette in evidenza la sostanza granulo-filamentosa, sotto forma di granuli isolati o riuniti tra loro da una rete più o meno fitta di materiale basofilo. I RETICOLOCITI

54 Contengono RNA (colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile) Contengono RNA (colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile) Sono più grandi dei globuli rossi MCVr > MCVgbr Sono più grandi dei globuli rossi MCVr > MCVgbr Possono avere un diverso contenuto di RNA (cioè un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione DOnofro e Zini Morfologia del Sangue DOnofro e Zini Morfologia del Sangue

55 Riduzione delle dimensioni Aumento della densità Perdita dei ribosomi, mitocondri e frammenti di membrana Riduzione di: RNA, mRNA e attività enzimatica Cambio della forma (plurilobata - biconcava) Perdita dei recettori di membrana per transferrina (CD71) e fibronectina Perdita di motilità e adesività Aumento della deformabilità Maturazione reticolocitaria

56 RMI = Reticulocyte Maturity Index Nei diversi studi è stato usato come: intensità media di tutta la popolazione reticolocitaria reticolociti ad elevata Fluorescenza o Assorbimento reticolociti a media ed elevata fluorescenza o assorbimento, che alla fine sono stati definiti come IRF = Immature Reticulocyte Fraction RMI = Reticulocyte Maturity Index Nei diversi studi è stato usato come: intensità media di tutta la popolazione reticolocitaria reticolociti ad elevata Fluorescenza o Assorbimento reticolociti a media ed elevata fluorescenza o assorbimento, che alla fine sono stati definiti come IRF = Immature Reticulocyte Fraction LMH

57 Frazione dei reticolociti immaturi (IRF) Contenuto emoglobinico reticolocitario Volume reticolocitario Nuovi parametri in citometria

58 Monitoraggio della ripresa midollare dopo trapianto o chemioterapia Monitoraggio della terapia delle anemie Monitoraggio della terapia con Epo Monitoraggio dellattecchimento del trapianto renale Rilevamento delle crisi aplastiche nelle anemie emolitiche IRF: applicazioni cliniche

59 Caratteristiche delle anemie emolitiche Anemie normocitiche-normocromiche Reticolociti Urobilinogeno Bilirubina indiretta Emoglobinemia ed Emoglobinuria LDH eritrocitaria

60 Caratteristiche delle anemie emolitiche Anemie emolitiche da cause intraglobulari Anemie emolitiche da cause extraglobulari Esame dirimente: Coombs test

61 Anemie Emolitiche Cause intraglobulari (difetti di membrana) Sferocitosi, ellissocitosi Cause intraglobulari (difetti enzimatici) Deficit di G6PD o Favismo Deficit di Piruvato K Deficit di Glutatione reduttasi Cause intraglobulari (Emoglobinopatie) Talassemie Drepanocitosi

62 Anemie emolitiche da cause extraglobulare Anemie emolitiche da isoanticorpi Anemie emolitiche da autoanticorpi Anemie da farmaci e veleni

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64 Elementi diagnostici delle anemie emolitiche da difetto intraeritrocitario ComuniSpecifici Segni di emolisiSegni di iper- funzione midollare Dipendenti dalla causa Bilirubinemia non coniugata ReticolocitosiMorfologia Emazie Urobilinogeno Iperplasia eritroblastica Emosiderosi LDH isoenzima 2 Turnover del Fe sideremia alla norma - Aumentata fragilità osmo­tica - Dosaggi enzimi eritrocitari (G6PD) - Elettroforesi Hb Aptoglobinemia


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