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Molecole Adesione 2. Caderine

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Presentazione sul tema: "Molecole Adesione 2. Caderine"— Transcript della presentazione:

1 Molecole Adesione 2. Caderine

2 Confocal immunofluorescent analysis of paraffin- embedded human breast carcinoma using E- Cadherin (24E10) Rabbit mAb (Alexa Fluor ® 488 Conjugate) (green). Blue pseudocolor = DRAQ5 ® (fluorescent DNA dye). Immunofluorescent analysis of HUVE cells using VE-Cadherin (D87F2) XP ® Rabbit mAb #2500 ( green ) and DAPI /DNA (blue). Actin filaments were labeled with DY-554 phalloidin (red).

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4 Developmental roles of cadherins. Halbleib J M, and Nelson W J Genes Dev. 2006;20: ©2006 by Cold Spring Harbor Laboratory Press

5 Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

6 ADESIONE NELLE GIUNZIONI ADERENTI E NEI DESMOSOMI Un importante ruolo per le caderine

7 Table 19-1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

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9 Figure 19-3 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

10 Table 19-2 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

11 Complesso giunzionale intercellulare

12 re/ jpg.html#

13 GIUNZIONI ADERENTI – DESMOSOMI A CINTURA – ZONULAE ADHERENS Giunzioni

14 Giunzioni aderenti (1) Sono particolarmente comuni negli epiteli, come nel rivestimento dell’intestino, dove appaiono come «cinture» che circondano ogni cellula vicino alla superficie apicale, legandola alla cellula vicina. Le cellule sono tenute insieme da legami Ca 2+ -dipendenti che si stabiliscono tra i domini extracellulari di molecole di adesione della famiglia delle caderine, che fanno da ponte attraverso lo spazio di 30 nm tra le cellule. Il dominio citoplasmatico di queste caderine è legato, tramite le catenine α e β ad una varietà di proteine citoplasmatiche, compresi i filamenti di actina del citoscheletro.

15 Giunzioni aderenti (2) I gruppi di caderina delle giunzioni aderenti: Collegono funzionalmente / meccanicamente l’ambiente esterno al citoscheletro di actina Forniscono una via potenziale di trasmissione di segnali dall’esterno della cellula al citoplasma: Es: le giunzioni aderenti tra le cellule endoteliali dei capillari trasmettono segnali che garantiscono la sopravvivenza delle cellule, mediati da VE-caderine.

16 Zonula adherens (desmosomi a cintura) Interazione con i filamenti di actina all’interno della cellula. Composta della molecola di adesione transmembrana E-caderina. La coda intracellulare della E-caderina si lega alla β-catenina sul versante citoplasmatico della membrana plasmatica, formando un complesso caderina-catenina. Questo complesso si lega a sua volta alla α-catenina e al citoscheletro di actina. La componente extracellulare della molecola di E-caderina si lega al Ca 2+ rendendo l’integrità morfologica e funzionale della zonula adherens dipendente dal calcio. La resistenza allo stress meccanico è limitata. Forma una banda o cintura continua che circonda completamente la cellula. Spazio di nm fra le membrana opposte che è trasparente agli elettroni nelle foto di microscopia elettronica.

17 DESMOSOMI – MACULAE ADHERENS Giunzioni

18 Desmosomi («maculae adherens») (1) Giunzioni adesive a forma di disco (diametro: cira 1 µm) presenti in diversi tessuti. Sono particolarmente abbondante nei tessuti soggetti a stress meccanici (es. muscolo cardiaco, strati epiteliali della cute e della cervice uterina). Come succede nelle giunzioni aderenti, contengono caderine che legano le due cellule attraverso un ristretto spazio extracellulare. Le caderine dei desmosomi hanno domini con struttura diversa rispetto alle caderine classiche presenti nelle giunzioni aderenti: Desmogleine Desmocolline Dense placche citoplasmatiche, sulla superficie interna delle membrane plasmatiche, servono da siti di ancoraggio ripiegati ad ansa per i filamenti intermedi. I domini citoplasmatici delle caderine dei desmosomi entrano in contatto, mediante altre proteine, con i filamenti intermedi.

19 Desmosomi («maculae adherens») (2) La rete tridimensionale di filamenti intermedi fornisce continuità strutturale e resistenza alla trazione all’intero strato di cellule. Pemphigus vulgaris: malattia autoimmune in cui vengono prodotti anticorpi contro le desmogleine. Malattia caratterizzata dalla perdita dell’adesione cellula- cellula nell’epidermide e da una estesa produzione di bolle nella cute.

20 Macula adherens (desmosoma a borchia) Interagisce con i filamenti intermedi (citocheratine nelle cellule epiteliali) Struttura discoidale (a borchia) sulla superficie di una cellula che è appaiata ad una struttura identica sulla superficie di una cellula adiacente. Placca circolare (placca di collegamento) di materiale fatto da circa 12 proteine sul versante citoplasmatico della membrana plasmatica. Ampio spazio intercellulare che contiene una banda mediana densa (al microscopio elettronico) contenente la proteina desmogleina. Filamenti intermedi di cheratina (cellule epiteliali; desmina nelle cellule muscolari cardiache) sono inseriti nella placca di collegamento e fanno un cappio che ritorna al citoplasma. Permettono un’adesione ferma fra le cellule.

21 Filamenti intermedi e giunzioni cellulari Le interazioni fra cellule negli strati cellulari dei tessuti o organi quali l’epidermide e il cuore è mediata in parte da desmosomi. Queste giunzioni cellula-cellula usano molecole di adesione specifiche dei desmosomi, Ca 2+ -dipendenti, quali le desmogleine e le desmocolline, e quindi si ancorano a diversi FI in modo tipo cellulare-specifico: alle cheratine negli epiteli alla desmina nei cardiomiociti alla vimentina nelle cellule della aracnoid mater e pia mater delle membrane (meningi) che avvolgono il sistema nervoso centrale, e di cellule endoteliali specializzate. (Herrmann et al. Intermediate filaments: from cell architecture to nanomechanics. Nature Rev Mol Cell Biol 8, , 2007)

22 Desmosome between epithelial cells “Rivets” Desmosome components attach to interior keratin intermediate filaments Desmosomes contain specialized cadherin proteins: desmoglein and desmocollin, extracellular Cytoplamic portions attach to plakoglobin and plakophilins, forming thick cytoplasmic plaques

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24 Principali funzioni cellulare dei filamenti intermedi Sostegno meccanico: L’epidermide è un buon esempio per illustrare questa funzione che è condivisa dalla maggior parte dei filamenti intermedi. I filamenti intermedi di tipo cheratina sono abbondanti nei cheratinociti, con un range fra > 10% del contenuto totale di proteine nelle cellule progenitrici basali fino a > 70% nelle cellule di differenziamento più avanzato. I cambiamenti nel colore dei filamenti riflettono l’espressione differenziale e la composizione delle cheratine nelle cellule basali, di differenziamento precoce e di differenziamento tardivo (la freccia indica il differenziamento). Le reti di filamenti di cheratina si estendono attraverso tutto il citoplasma dei singoli cheratinociti e sono integrate fra cellule mediante collegamento alle giunzioni cellula-cellula di tipo desmosomi (punti rossi) e fra le cellule basali e la lamina basale mediante collegamento ad emi-desmosomi (punti gialli). Questa organizzazione massimizza il sostegno meccanico fornito dai filamenti di cheratina.

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26 STRUTTURA Caderine

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28 Pettitt J. The cadherin superfamily. WormBook Dec 29:1-9. Diversità strutturale della superfamiglia delle caderine in C. elegans.

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30 Van Roy & Berg, 2008

31 Cellula tumorale Cellula endoteliale Cellula stromale

32 Caderine (1) Superfamiglia di recettori di adesione espressa da tutte le cellule che formano tessuti solidi Mediano interazioni omotipiche nelle giunzioni aderenti, giunzione occludenti (“tight junctions”), giunzioni comunicanti (“gap junctions”) e desmosomi. Un tipo cellulare può esprimere molteplici caderine. L’espressione di caderine è tessuto-specifica. La superfamiglia delle caderine può essere suddivisa nelle: o caderine classiche tipo I e II o caderine dei desmosomi o protocaderine o altre proteine correlate alle caderine.

33 Caderine classiche Contengono una regione N-terminale extracellulare di grandi dimensioni che consiste in domini a botte  ripetuti che contengono siti di legame per il Ca 2+. Il C-terminale consiste in una regione transmembrana e in un dominio citoplasmatico, mediante il quale le caderine interagiscono con le catenine, molecole citoplasmatiche che collegano le caderine alle componenti citoscheletriche. Posseggono un dominio citoplasmatico conservato che interagisce sia con la catenina-  che con la catenina - , che a loro volta si legano con una catenina- . La catenina-  è una proteina che lega l’actina (Actin-binding protein, ABP) che collega il complesso caderina-catenine al citoscheletro. Questo ancoraggio intracellulare è richiesto per un’adesione cellulare mediata da caderine funzionante.

34 CADERINE CLASSICHE DI TIPO I: E-CADERINE Si trovano nella maggior parte dei tessuti epiteliali e sono richieste per molti aspetti della morfogenesi epiteliale. Una ridotta espressione di caderine correla con l’invasività e potenziale metastatico dei tumori umani, il che suggerisce che la disfunzione delle E-caderine possa contribuire alla progressione dei carcinomi. Oltre che al legame omofilico, la E-caderina può legarsi all’integrina  IEL  7.

35 Figure 5 Effect of XO+X on immunofluorescence localization of E- cadherin and [beta]-catenin: Y-sections Biochemical Journal (2002) 368,

36 CADERINE CLASSICHE DI TIPO I: N-CADERINE o La N-caderina è espressa nelle cellule endoteliali, cellule neurali e alcuni tipi di tessuto muscolare; inoltre ha il potere di promuovere l’attività di crescita dei neuriti.

37 CADERINE CLASSICHE DI TIPO I: P-CADERINE La P- caderina è particolarmente espressa nel tessuto embrionale e nella placenta. L’espressione di P-caderina durante l’embriogenesi è regolata in modo dipendente dalla fase di sviluppo e sembra essere diversa nei topi rispetto agli esseri umani.

38 Struttura a domini delle caderine. Shapiro & Weis, 2009 Le caderine più note sono le “caderine classiche” dei vertebrati, e le caderine desmosomali ad esse strettamente correlate. Queste protein contengono un prodomio (P) che segue immediatamente la sequenza segnale, che viene rimossa mediante proteolidi. Le caderine mature classiche e desmosomali hanno ectodomini composti da cinque ripetizioni extracellulari di tipo caderina (EC), una semplice regione transmembrane, e un dominio citoplasmatico che interagisce sia con la β-catenina (caderine classiche) o con la placcoglobina (nota anche come g-catenina) (caderine desmosomali). Altri membri della famiglias delle caderine hanno domini con strutture molto diverse, come illustrato dal diagramma della caderina DN della Drosophila.

39 Leckband & Prakasam, 2006

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41 Struttura di base delle caderine La magggior parte delle caderine comprende un N-terminale extracellulare che contiene 5-6 ripetizioni di domini caderinici, una corta regione transmembrana e un C-terminale intracellulare. L’unità ripetuta caderinica ha circa 110 aminoacidi e consiste in sette filamenti disposti in una struttura compatta a β-barile simile alla ripetizioni di tipo Ig. Queste ripetizioni sono collegate da motivi che legano il Ca 2+ altamente conservati che forniscono stabilità al dominio extracellualre. I domini caderinici sono numerati; quello più vicino al N-terminale è denominato «Extracellular cadherin 1» (EC1). Il dominio intracellulare C-terminale si lega a una gran varietà di molecole che collegano le caderine al citoscheletro. Coombe & Dye, In: Adhesion Molecules, CRC Press, 2010

42 Caderine classiche (tipo I) (1) Sono state le prime ad essere identificate e sono nominate in funzione dei tessuti in cui sono state identificate. Il dominio extracellulare consiste in un pre-dominio N-terminale seguito da 5 domini EC; il EC5 è caratterizzato da 4 cisteine conservate non presenti negli altri domini. Il EC1 contiene un triptofano [W] conservato in posizione 2 nella proteina matura [W2] e una tasca idrofobica in grado di accomodare il W2 di un dominio EC1 vicino. Coombe & Dye, In: Adhesion Molecules, CRC Press, 2010

43 Parisini et al., 2007 Schema della struttura del dimero di filamenti dei domini EC1-EC2 di E- caderina umana. Le due molecole sono correlate da un asse di simmetria binaria. Ogni molecola interagente inserisce il suo residuo Trp-2 nella tasca accettrice della molecola correlata della diade. Tre atomi di Ca 2+, qui illustrati da cerchi rossi, si trovano all’interfaccia fra i singoli domini caderinici della E- caderina, in questo modo conferendo rigidità alla molecola. Atomi di Ca 2+

44 Parisini et al., 2007 Dettagli delle interazioni tra la porzione N-terminali della molecola A (magenta) e la tasca accettrice idrofobica della molecola B (verde) all’interno di un dimero di filamenti. Le linee tratteggiate mostrano i legami ionici fra i residui A Asp1-NH 3 + e B Glu89, nonchè i legami di idrogeno fra N  H dell’ A Trp2 e il gruppo carbonilico di B Asp90. Anche la disposizione acattastata dei residui B Glu89, A Trp2 e B Met92 (vedi inserto in alto a sinistra) probabilmente contribuisce alla stabilizzazione di questa interazione tipo «chiave-serratura» che si osserva in tutte le molecole di caderina.

45 Figure 19-9a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

46 Caderine classiche (tipo I) (2) Dopo la rimozione del pre-dominio (nel Reticolo Endoplasmatico), i residui N-terminali [che includono il triptofano in posizione 2 (W2)], formano un «braccio di adesione» che interagisce con la «tasca accettrice» nel corpo dell’EC1; si forma inoltre un legame ionico tra il N-terminale carico positivamente di un asparagina (Asp) in posizione 1 [D1] e un residuo conservato di acido glutamico [E89] vicino alla tasca accettrice. Se questa interazione ha luogo nell’ambito della stessa molecola di caderina, la molecola è «chiusa» e non è in grado di dimerizzare. La forma «chiusa» è in equilibrio con un forma «aperta» che può interagire con altre molecole sulla stessa cellula (cis) e quindi fra molecole su cellule vicine (trans) per mediare adesione cellula-cellula omofilica.

47 Caderine classiche (tipo I) (3) Si ha adesione omofilica quando l’ancoraggio tra due molecole diverse è fatto mediante «dimerizzazione con scambio di filamenti» («strand swap»). Un tripeptide che consiste in istidina, alanina e valina( [HIV], aminoacidi 79-81] all’interno di EC1 è una sequenza di riconoscimento essenziale per l’adesione cellulare mediata dalla caderine di tipo 1. Le caderine classiche manifestano specificità omofilica: –La E-caderina si lega più fortemente alla E-caderina di quando non non si leghi con altre caderine.

48 Caderine classiche (tipo I) (4) I domini citplasmatici delle caderine classiche interagiscono con proteine coinvolte nell’endocitosi e nel segnalamento intracellulare ed anche con il citoscheletro di actina. Le interazioni con l’actina sono cruciali per la loro aggregazione e per formare adesioni cellula-cellula stabili. La coda citoplasmatica delle caderine ha un «juxtamembrane domain» (JMD) e un «C-terminal catenin-binding domain» (CBD). Il JMD si lega alla catenina p-120 e stabilizza la molecola alla superficie cellulare mentre il CBD si lega alla β-catenina che lega le caderine classiche al citoscheletro di actina mediante intermediari quali la α-catenina e la vinculina.

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51 Rimescolamento (“swapping”) dei domini EC1-EC1. Il dominio EC più esterno delle caderine (EC1) può essere coinvolto in interazioni di tipo trans formando un’interfaccia dimerica. Nei monomeri “chiusi” di caderina, il foglietto β A del domio EC1 è trattenuto sotto tensione conformazionale mediante ancoraggio mediato dal Trp-2 ad una estremità e la glutamina-11 legata al Ca2+ dell’altra estremità. Questa conformazione favorisce il “swapping’ dei foglietti β su domini caderinici EC1 opposti. Nel dimero rimescolato, la catena laterale del triptofano-2 conservato nel dominio EC1 si inserisce nella tasca idrofobica presente nel dominio EC1 opposto.

52 Gumbiner, 2005

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54 Leckband & Prakasam 2008

55 Wu, 2011

56 Caderine di tipo II Hanno un pre-dominio più corto delle caderine classiche, mancano di sequenza di riconoscimento HAV (histidine, alanine, valine), e hanno due residui conservati di triptofano in EC1 nelle posizioni 2 e 4 [W2 e W4] della proteina matura (dopo che il pre-dominio è stato eliminato nell’ER), con una tasca di riconoscimento più ampia. I domini EC1 di di caderine di tipo II vicine dimerizzano in modo simile a quello delle caderine di tipo I, con W2 e W4 che si inseriscono in un sito accettore su una molecola vicina e un legame salino che si forma tra il N- terminale e un residuo conservato di acido glutamico. Tuttavia, le caderine di tipo II hanno una maggiore tendenza a formare legami eterofilici con altri sotto-membri del tipo II di quanto non lo facciano le caderine di tipo I. Il dominio intracellulare delle caderine di tipo II è simile a quello delle caderine di tipo I tranne che nel fatto che il CBD si lega alla γ-catenina invece che alla β-catenina.

57 CADERINE CLASSICHE DI TIPO II: CADERINE 5-12 SCOPERTE RECENTEMENTE La caderina 5 (VE-caderina) è ristretta alle cellule endoteliali e può essere importante nell’angiogenesi e nel controllo della permeabilità vascolare.

58 Caderine desmosomali (1) Nell’Uomo ci sono 7 caderine desmosomali: tre desmocolline (DSC 1-3) e quattro desmogleine (DSG 1-4). Entrambe le famiglie hanno 5 domini EC, nonostante il 5° dominio sia meno ben conservato. I domini EC1 delle proteine desmocollina e desmogleine sono strutturalmente simili a quelli delle proteine classiche (ad es. un triptofano [W2] e un acido glutamico [E89] conservati) ed è probabile che dimerizzino anche essi tramite «strand swapping» (scambio di filamenti). Si ritiene che le caderine desmosomali formino dimeri cis all’interno del desmosoma, che interagiscono con dimeri su una cellula vicina, con preferenza fra interazioni eterofiliche fra proteine DSC e DSG.

59 Caderine desmosomali (2) Le proteine desmocolline (DSC) e desmogleine (DSG) differiscono dalla caderine classiche e una dall’altra nei loro domini citoplasmatici. Entrambi i gruppi contengono un dominio intracellulare prossimale di ancoraggio alla membrana che corrisponde al JMD delle caderine di tipo I e un «intracellular cadherin segment» (ICS) simile al CBD delle caderine classiche Tuttavia il ICS delle proteine DSC e DSG si lega predominantemente alla γ-catenina e collega ai filamenti intermedi.

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61 Protocaderine (1) Sono il gruppo più esteso di caderine con almeno 70 membri. Hanno 5 o 7 domini EC, un unica regione transmembrana e domini citoplasmatici divergenti. I suoi membri non contengono un residuo di triptofano in posizione 2 (W2) nè un sito accettore conservati nel loro dominio EC1. Vice-versa, hanno due residui di cisteina conservati e un loop S-S nel loro dominio EC1 e un motivo RGD (arginina, glicina, aspartato).

62 Morishita &Yagi, 2007

63 Struttura proteica del dominio EC1 di una protocaderina

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65 Protocaderine (2) E’ interessante notare che le protocaderine mediano adesioni omofiliche e eterofiliche in conformazione cis e possono essere coinvolte in adesione omofilica trans dopo avere formato complessi con altre molecole. Sono stati identificati pochi partners di legame per i domini intracellulari, ma uno è la tirosina chinasi Fyn, che si lega al dominio costante della famiglia delle α-protocaderine.

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67 Stetefeld & Ruegg, 2005

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69 MODULAZIONE DELL’ADESIVITA’ Caderine

70 Alcune cellule possono regolare l’adesività delle loro caderine. Questa regolazione può essere importante per i riarrangiamenti cellulari che hanno luogo negli epiteli quando questi strati di cellule alterano la loro forma e organizzazione durante lo sviluppo embrionale. Le basi molecolari di questa regolazione sono poco note ma potrebbero coinvolgere la fosforilazione di proteine di ancoraggio collegate alla coda citoplasmatica delle caderina.

71 Kobielak & Fuchs, 2004 Vedi didascalia dopo

72 Un complesso multiproteico nelle giunzioni aderenti (didascalia 1) La regione extracellulare della E-caderina, che contiene domini caderinici extracellulare (EC), subisce alterazioni conformazionali Ca 2+ -dipendenti che le permettono di omodimerizzare sulla membrana. Mediante interazioni extracellulari con le E-caderine sulle cellule vicine, i dimeri di caderina opposti possono integrare il citoscheletro di actina. La stabilizzazione dell’adesione intercellulare richiede il dominio citoplasmatico della E-caderina, che si lega alla β-catenina. A sua volta la β-catenina si lega all’α-catenina, che è fondamentale per reclutare un gran numero di protein del citoscheletro, incluso le protein formina (Fmn) che nucleano la formazione dell’actina filamentosa (F-actina), e le protein leganti l’actina vinculin, Ajuba, myosin VIIA, vezatin, α-actinin e membri della famiglia di allungamento della F-actina della famiglia dei “vasodilator-stimulated phosphoprotein” (VASP).vinculinAjubamyosin VIIAvezatin

73 Un complesso multiproteico nelle giunzioni aderenti (didascalia 2) Almeno alcune di queste interazioni sono essenziali per la polimerizzazione e l’organizzazione dell’actina in cavi che aiutano a sigilare le membrane e ad integrare il citoscheletro di actina attorno lo strato epiteliale. Viceversa, la catenina p120 catenina (p120), che è correlate alla β- catenina, si lega alla E-caderina mediante un dominio vicino alla membrane e sembra svolgere un ruolo nel turnover della caderina, forse regolando il traffic di caderina.

74 Funzioni simili e distinte delle protein caderina-catenina nell’epidermide della pelle Lien W et al. PNAS 2008;105: ©2008 by National Academy of Sciences Lo schema illustra le connessioni fra le protein caderina-catenine e i fenotipi cellular rivelati da esperimenti “loss-of-function”. Mentre le caderine sembrano essere principalmente responsabili dell’integrità meccanica del tessuto, le catenine sono anche coinvolte nella regolazione di diverse vie di trasduzione del segnale.

75 TRASDUZIONE DI SEGNALE Caderine

76 Alcune caderine possono collaborare alla trasmissione di segnali verso l’interno della cellula. La caderina vasculo- endoteliale (VE-caderina), ad esempio, media non solo l’adesione fra cellule endoteliali ma viene anche richiesta per la sopravivenza dell’endotelio. Nonostante le cellule endoteliali che non esprimono la VE-caderina siano ancora in grado di aderire una all’altra tramite la N-caderina, esse non sopravvivono e vanno incontro ad apoptosi. La loro sopravvivenza dipende da una proteina segnalatrice extracellulare chiamata Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), il quale si lega ad un recettore ad attività tirosina chinasica che usa la VE-caderina come co-recettore.

77 Cavallaro & Dejana, 2011

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79 VE-cadherin is a critical endothelial regulator of TGF-beta signalling (Rudini N, Felici A, Giampietro C, Lampugnani M, Corada M, Swirsding K, Garrè M, Liebner S, Letarte M, ten Dijke P, Dejana E. VE- cadherin is a critical endothelial regulator of TGF-beta signalling. EMBO J Apr 9;27(7): ) Modello proposto per il ruolo della VE-caderina nell’endotelio quiescente. La VE-caderina regola le vie di segnalazione VEGF/ERK1/2 e TGF-beta/Smad in modo opposto ma con risultato finale identico nelle cellule endoteliali. La formazione del complesso VE-caderina– VEGFR-2 limita la proliferazione cellulare impedendo l’attivazione di ERK1/2 MAPK. La formazione del complesso VE-caderina–TbetaR promuove la fosforilazione indotta da TGF- beta di Smad, il che porta alla stabilizzazione vascolare.

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