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YT. Media Type Composition –Buffer (phosphate based) –Nitrogen source (ammonium chloride or ammonium sulfate) –Carbon Source (glucose or glycerol) –Trace.

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Presentazione sul tema: "YT. Media Type Composition –Buffer (phosphate based) –Nitrogen source (ammonium chloride or ammonium sulfate) –Carbon Source (glucose or glycerol) –Trace."— Transcript della presentazione:

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2 Media Type Composition –Buffer (phosphate based) –Nitrogen source (ammonium chloride or ammonium sulfate) –Carbon Source (glucose or glycerol) –Trace Metals (Ca, Co, Cu, Fe, Mn, Mo, Se and Zn) –Vitamins (Biotin, thiamine, folic acid, riboflavin, niacinamide, PABA, pantothenic acid and pyridoxine) Composition –Tryptone –Yeast extract –Sodium Chloride Examples –Luria Broth (LB) –2xYT –TB (phosphate buffered) Rich Media Chemically Defined

3 M9 medium is a minimal growth medium used for bacterial cultures. It has the advantage of being cheap M9 minimal medium  Isotopically labeled proteins can be prepared straightforwardly in E. coli by growing cells in minimal media M9 supplemented with appropriate nutrients ( 15 NH4Cl, 13 C-glucose)  For large proteins deuterium labeling provides simplified spectra for the remaining 1 H nuclei and has useful effects on relaxation properties of attached or adjacent atoms ( 1 H, 15 N, 13 C). 1x M9 salts 2mM MgSO 4 0.1mM CaCl 2 0.4% carbon source (e.g. glycerol, glucose, etc.) 1g nitrogen source ( 15 N) In sterile H 2 O 5X M9 salts contains: 64 g Na 2 HPO 4.7H 2 O 15 g KH 2 PO g NaCl 5 g NH 4 Cl dissolved in deionized water to a final volume of 1 L

4 Rich vs. Minimal Media pET expression of At3g17210 pQE expression of At3g17210

5 Parametri delle colture

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7 Temperatura Da 16°C a 37°C Surf1 pTH24 C41 25° Surf1 pTH24 C41 18° M IB Prot FT1 FT2 W1 W2 W3 W4 W5 E1 E2 E3M IB IB Prot FT1 FT2 W1 W2 W3 W4 W5 E1 E2 E3

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9 IPTG  Differenti concentrazioni 1mM - 0.1mM  Induzioni a tempi diversi

10 FASE DI LATENZA: intervallo di tempo in cui i microrganismi si adattano all’ambiente (non si moltiplicano) FASE ESPONENZIALE: periodo di tempo in cui i microrganismi si moltiplicano in modo progressivo e costante PLATEAU: si stabilisce un equilibrio tra il numero delle cellule che si moltiplicano e il numero di cellule che muoiono FASE DELLA MORTE: cessa la moltiplicazione dei microrganismi che invecchiano e muoiono t Unità formanti colonie latenza esponenziale plateau morte

11 Trasformazione del DNA per espressione proteica Trasformazione in BL21 A  l di cellule competenti di E. coli (BL21) si aggiungono X  l (corrispondenti a 100 ng) di uno dei campioni di DNA plasmidico che hanno dato risultato positivo allo screening. Controllo: in parallelo compiere la stessa reazione aggiungendo X  l di acqua sterile invece del plasmide. 30’, ghiaccio 90’’, 42°C 2’, ghiaccio aggiungere  l 2xYT, 1h shaker a 37°C, 150 rpm. Strisciare su piastre contenenti 2xYT + amp (200  g/ml),  l di ognuna delle trasformazioni. O/N, 37°C

12 Coltura massiva  Inoculo Si prelevano singole colonie che vengono trasferite in alcuni ml di terreno liquido. Si lascia incubare in shaker alla temp. opportuna per il ceppo batterico, per circa ore (fase stazionaria)  Coltura massiva L’inoculo viene trasferito in alcuni litri di terreno liquido, 1% in volume. Si lascia incubare in shaker alla temp. opportuna. All’inizio della fase esponenziale l’espressione della proteina viene indotta per aggiunta di un induttore che determina l’avvio della trascrizione proteica tempo di incubazione fase esponenziale Abs 600 +IPTG raccolta cellule IPTG

13 Procedura per l’espressione di rame proteina Preparazione inoculo da piastra Inoculare 2 tubi contenenti ciascuno 6 ml di 2xYT + amp (200  g/ml) con 2-3 colonie prelevata da piastra. Mettere ad incubare in shaker O/N a 37°C. Preparazione coltura massiva Inoculare 2 beute da 2l contenenti ciascuna 0.5 l 2xYT + amp (200  g/ml) con 5 ml di inoculo già preparato. Mettere ad incubare in shaker a 37°C. Misurare ad intervalli regolari la densità ottica a 600 nm. Quando la densità ottica raggiunge il valore di 0.6, aggiungere a ciascuna beuta 1.0 ml di soluzione di IPTG 0.5 M (concentrazione finale 1 mM) e 125  l di soluzione di CuSO 4 1 M Continuare l’incubazione in shaker alla temperatura di 25°C per 16 h. Aggiungere 375  l di soluzione di CuSO 4 1 M 45’ prima di raccogliere le cellule Isolamento della proteina Rottura delle cellule Separazione dell’estratto dalle cellule

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18 Ottimizzazione per lo scale-up

19 Minifors fermenters Interactive control of culture parameters: Temp, pH, pO 2 Parameters can be automatically changed during the culture from a computer Possibility of feed/continuous cultures

20 GESTIONE DEI PARAMETRI DI PROCESSO Temperaturariscaldamento/raffreddamento Agitazioneimpostazione/variazione di un “ set point ” Flusso ariaimpostazione/variazione di un “ set point ” pHaggiunte di acido/base e/o feed pO 2 agitazione/ flusso aria/ arricchimento in O 2 e/o feed Schiumaaggiunte di antischiuma Alimentazioneimpostazione/variazione di un ciclo di attivit à della pompa del feed

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22 Nei processi di estrazione e purificazione delle proteine, a differenza di quanto avviene per il DNA/cellule, non occorre prestare attenzione alla sterilità ma bisogna evitare la denaturazione dei campioni (elevate temperature, detergenti, valori estremi di pH possono denaturare facilmente le proteine) Inoltre è importate procedere all’estrazione delle proteine il più velocemente possibile, per evitare processi degradativi. Per conservare i campioni da cui estrarre le proteine vanno congelati rapidamente in azoto liquido (-140°C) e poi conservati in frigo a - 80°C

23 ESTRAZIONE______________________________________________ LISI DELLE CELLULE  Localizzazione della proteina  Tipo di cellule  Quantità di cellule BUFFER DI LISI  Localizzazione della proteina  Parametri chimico-fisici della proteina (pI, idrofobicità, …)  Presenza di Cys ridotte/ossidate  Metalli  Regioni transmembrana  Attività proteolitica  Rimozione di acidi nucleici CHIARIFICAZIONE  Centrifugazione  Ultrafiltrazione

24 Proteine extracellulari secrete nel terreno di cultura o nel siero possono essere rimosse dal materiale insolubile per semplice centrifugazione Proteine intracellulari possono essere recuperate dopo rottura delle cellule La procedura adottate per ottenere un estratto grezzo (estratto contenente tutte le proteine cellulari solubili nel tampone di estrazione utilizzato) dipende dalla localizzazione cellulare della proteina di interesse.

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26 I metodi utilizzati per la rottura delle cellule dipendono in gran parte dalla fragilità delle cellule Cellule animali -Cellule fragili (eritrociti) -Cellule che contengono materiale fibroso (c. muscolari) Cellule vegetali Più difficili da rompere perché contengono cellulosa Microorganismi -Batteri che si lisano facilmente -Batteri con pareti più resistenti

27 Utilizzo di detergenti per dissolvere la membrana cellulare

28 Proteine di secrezione  Le proteine contengono segnali che ne determinano la destinazione. Una proteina può restare nel citosol, può essere portata sulle membrane plasmatica o interna, nello spazio intermembrana o nel mezzo intracellulare.  Sequenze segnale aminoterminali (16-26 AA) dirigono le proteine batteriche attraverso le membrane plasmatiche od esterne del batterio. Vengono riconosciute e tagliate da opportune peptidasi  Proteine secrete nel periplasma possono essere recuperate per rottura della sola membrana esterna (shock osmotico)

29 Shock osmotico Per 1 litro di coltura  Centrifugare la cultura a 8000 rpm per 10’, 4°C.  Disperdere il pellet in 50 ml Tris-HCl 10 mM a pH 7.5. Aggiungere 50 ml di soluzione di saccarosio al 40% in 10 mM Tris-HCl pH ml di soluzione EDTA 0.5 mM pH 8. Le soluzioni devono essere ice-cold. Tenere in agitazione in ghiaccio in camera fredda per 20’.  Centrifugare rpm per 15’ a 4°C. Rimuovere accuratamente il surnatante.  Disperdere il pellet in 30 ml H 2 O fredda tenere in bagno di ghiaccio per 20’. Centrifugare per rpm per 15‘ a 4°C. Raccogliere accuratamente il surnatante che contiene la proteina.  Disperdere nuovamente il pellet in 20 ml H 2 O fredda e tenere ancora per 20’ in bagno di ghiaccio sotto agitazione.  Centrifugare a rpm per 15’ a 4°C e raccogliere il surnatante. Riunire i due surnatanti.

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31 LISI DELLE CELLULE

32 Tecniche di rottura delle cellule

33 Uso del lisozima nella rottura della parete cellulare Il lisozima lisa alcuni tipi di batteri rompendo la componente polisaccaridica della parete, formata da 2 tipi di zuccheri, N-acetilglucosamina (NAM) e da acido N-acetilmuranico (NAG). La parete perde rigidita’ e il batterio scoppia a causa dell’elevata pressione osmotica intracellulare Il lisozima idrolizza il legame glicosidico tra il C-1 del NAM e il C-4 del NAG

34 Alcuni sistemi per rompere le cellule

35 Vari modelli di omogeneizzatore.

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40 I buffer più utilizzati sono: Fosfato – Tris – HEPES (pH: 5.8-9) Concentrazioni del buffer: mM Tris: il pH dipende dalla temperatura  pKa: 8.06 a 25°C 8.85 a 0°C SCELTA DEL BUFFER DI LISI

41 BufferpH range Citric acid - NaOH Sodium citrate - citric acid Sodium acetate - acetic acid Cacodylic acid sodium salt - HCl MES - NaOH Sodium dihydrogen phosphate - disodium hydrogen phosphate Imidazole - HCl MOPS - KOH Triethanolamine hydrochloride - NaOH Tris - HCl HEPES - NaOH Tricine - NaOH Sodium tetraborate - boric acid Bicine - NaOH Glycine - NaOH SCELTA DEL BUFFER DI LISI

42 TAMPONI COMMERCIALI

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44 SCELTA DEL BUFFER DI LISI Class of additiveexampleconcentrationpurpose SaltsNaCl, KCl, (NH 4 ) 2 SO mMmaintain ionic strength of medium DetergentsDeoxycholate, Triton X %solubilization of poorly soluble proteins Glycerol 5-10%stabilization Glucose or sucrose 25 mMStabilize lysosymal membranes, reduce protease release Metal chelatorsEDTA, EGTA1 mMreduce oxidation damage, chelate metal ions Reducing agentsDTT, DTE 2- Mercaptoethano l 1-10 mM 0.05% reduce oxidation damage Ligands, metal ionsMg 2+, ATP, GTP1-10 mMstabilization Protease InhibitorsPMSF, Aprotinin,…Reduced protease activity DNaseDNAse I U/mlReduced solution viscosity ADDITIVI:  Aumentano la stabilità della proteina  Aumentano la solubilità della proteina

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47 - 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1- propanesulfonate - Molecular Weight: g - Micelle Molecular Weight: 6149g - Critical Micelle Concentration (CMC): 8 to 10mM - Dialyzable: Yes

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53 Un’analisi di sequenza della proteina target può evidenziare siti di taglio per specifiche proteasi E’ importante lavorare a basse temperature

54 Ottimizzazione dell’estratto  Il tampone di estrazione deve avere composizione salina e pH piu’ simile possibile alle condizioni cellulari, per mantenere in soluzione le proteine Forza ionica M pH Generalmente 2-3 volumi di tampone rispetto al volume del pellet. Maggiore il volume minore sarà la % di proteine perse nel pellet  Tipici tamponi utilizzati sono mM fosfato o Tris-HCl o HEPES  Talvolta vengono aggiunti specifici stabilizzanti come, detergenti, EDTA, inibitori delle proteasi e reagenti contenenti gruppi sulfidrilici come  -mercaptoetanolo e ditiotreitolo (5-20mM) Questi hanno lo scopo di proteggere i residui cisteinici dall’ossigeno I gruppi SH delle cisteine esposti all’ossigeno possono 1)formare legami disolfuro –S-S- 2)ossidarsi a gruppi solfinici –S-OH 3)ossidarsi a gruppi solfonici La reazione 1) puo’ essere accelerata da ioni metallici. EDTA rimuove gli ioni metallici Reagenti con gruppi SH si ossidano all’ossigeno al posto delle cisteine

55 Chiarificazione dell’estratto  L’estratto proteico, dopo la rottura delle cellule può essere viscoso per la presenza di acidi nucleici Questi possono essere rimossi:  per aggiunta di RNAasi e DNAsi  per precipitazione con solfato di protamina (composto policationico estratto da pesci) La protamina interagisce elettrostaticamente con gli acidi nucleici. Si forma un complesso che precipita a f. ionica non troppo elevata (< 0.1 M) e ne provoca la precipitazione  L’estratto viene chiarificato da organelli, frammenti di membrana e precipitati per centrifugazione.

56 CHIARIFICAZIONE: CENTRIFUGAZIONE La velocità e la durata della centrifugazione dipendono dal coefficiente di sedimentazione (S) delle particelle da separare: Il coefficiente di sedimentazione è un numero adimensionale che misura il rapporto tra la velocità di sedimentazione di un corpo ideale (sfera) e quella del corpo in esame, a parità di condizioni di riferimento. In alcuni casi è espresso come unità di misura non SI denominata Svedberg ω = velocità angolare [rad sec-1] = x RPM (rotazioni per min) r = distanza tra la particella ed il centro del rotore [mm] dr/dt = velocità di sedimentazione della particella [cm sec -1 ] dr/dt = [2/9  r 2 p  (  p -  m )   2  r]/  S = 1/ω 2 r x dr/dt Differenza tra la sua densità e quella del mezzo Coefficiente di viscosità del mezzo 1 Svedberg = 10 –13 sec S enzimi, ormoni peptidici, proteine solubili 2-25 s Acidi nucleici3-100 s Ribosomi e polisomi s virus s lisosomi4.000 s membrane x10 3 s mitocondri20x10 3 S-70x10 3 s nuclei4.000x10 3 S x10 3 s Dimensione della particella

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58 CHIARIFICAZIONE: ULTRAFILTRAZIONE Separazione tramite filtrazione con membrane a diverso CUT-OFF

59 ESTRAZIONE DI PROTEINE ESPRESSE IN CORPI DI INCLUSIONE

60 REFOLDING: L’agente denaturante viene rimosso per permettere la rinaturazione della proteina Tecniche di refolding: REFOLDING DIRETTO DIALISI REFOLDING IN COLONNA (proteine di fusione) Metodo sperimentale  proprietà chimico-fisiche della proteina

61 Preparazione materiale e soluzioni  Sterilizzare materiale (punte, eppendorf, tubi da PCR)  Sterilizzare 4 beute da 2 l, con 0.5 l ciascuna di 2  YT  Sterilizzare H 2 O  Preparare 2  0.5 l 2  YT sterile  Preparare 2  10 ml amp sterile 1000  (2g/10 ml)  Preparare 2  5 ml IPTG sterile (0.5 M)  Preparare 2  10 piastre 2  YT agar + amp (200  g/ ml) Soluzione sterile di ampicillina (2 g/10 ml) Sciogliere 2 g di ampicillina in 10 ml di H 2 O Sterilizzare per filtrazione in Falcon sterile Soluzione sterile di IPTG Sciogliere la quantità opportuna di IPTG, per avere soluzione 0.5 M, in 5 ml di H 2 O. Sterilizzare per filtrazione in Falcon sterile

62 Preparazione materiale e soluzioni 2  YT 0.5 l triptone 8.0 g estratto di lievito 5.0 g NaCl2.5 g Portare a volume con H 2 O – Sterilizzare in autoclave, 120 °C, 1 bar, 30’. 2  YT agar 0.5 l triptone 8.0 g estratto di lievito 5.0 g NaCl 2.5 g Agar-agar10.0 g Portare a volume con H 2 O – Sterilizzare in autoclave, 120 °C, 1 bar, 30’. Aggiungere soluzione ampicillina sterile (concentrazione finale 200  g/ ml, 0.5 ml su 0.5 l) quando la soluzione e’ quasi fredda, prima che solidifichi


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