… contro la «fumaggine» causata da Alternaria spp.

Presentazione sul tema: "… contro la «fumaggine» causata da Alternaria spp."— Transcript della presentazione:

1 Strategie di difesa con agenti di biocontrollo in pre- e post-harvest …
… contro la «fumaggine» causata da Alternaria spp. Moruzzi Serena, Martini Marta Università degli Studi di Udine, DISA

2 Presentazione del problema
2000: prime segnalazioni in FVG di alterazioni della buccia delle mele in campo e in ambiente di conservazione Osservazione dei sintomi Presenza di fumaggine Diagnosi di routine Indagini fitopatologiche (stereomicroscopio e isolamento) Presenza di agenti fungini

3 Presentazione del problema
2008: Università di Udine, DISA (p.a. Borselli S., prof. Osler R., dott. Grisan S., dott. Poggetti L.) Agenzia Regionale per lo Sviluppo Rurale (dott. Benvenuto L., dott. Malossini G., dott. Frausin C.) FriulFruct (dott. Zampa C.) hanno iniziato progetto di ricerca sulla malattia: Ricerca bibliografica Sintomatologia e diffusione della malattia: campo e ambiente di conservazione Eziologia della malattia (identificazione agente/i patogeno/i): isolamento microrganismi e loro identificazione, postulati di Koch Individuazione strategia di lotta/controllo: chimico biologico

4 1. Ricerca bibliografica
Problematiche simili (malattie epifitiche) risultavano comuni nelle zone temperate e umide: diffuse in gran parte degli Stati Uniti, Europa (Olanda, Norvegia, Germania, Slovenia, Serbia, Polonia), Turchia, Giappone, Cina, Brasile In Italia segnalazioni in Trentino Alto Adige, Piemonte, Emilia Romagna e Friuli Venezia Giulia (Lindner, 2009; Grosso et al., 2011) Malattia Agenti causali - Gloeodes pomigena (Schweinitz, 1832) - Peltaster fructicola (Johnson et al., 1997) - Leptodontium elatius (Johnson et al., 1997) Geastrumia polystigmatis (Johnson et al., 1997) 80 nuove presunte specie (anni 2000), tra cui: Tripospermum spp. (Grabowski, 2007); Microcyclospora spp., Stomiopeltis spp., Microcyclosporella spp. (Gleason et al., 2011) Classe Dothideomycetes, ordine Capnodiales (95%) Sooty blotch (maculatura fuligginosa)

5 1. Ricerca bibliografica
Malattia Agenti causali Flyspeck (macchiolina di mosca) Schizothyrium pomi (Von Arx , 1959) Zygophiala jamaicensis (Mason, 1945) 10 nuove presunte specie (anni 2000), tra cui: Ramularia spp., Dissoconium spp. (Gleason et al., 2011) White haze (patina bianca) - Tilletiopsis spp. (Boekhout et al., 2006)

6 2. Sintomatologia Tipica delle malattie epifitiche (fumaggini) che si sviluppano a spese degli strati più superficiali e inerti del frutto: Striature diffuse sulla maggior parte della superficie del frutto, concentrate soprattutto (colore nero più intenso) nei dintorni della base del peduncolo e della depressione calicina; frequentemente sembrano descrivere il percorso di un percolamento, probabilmente in corrispondenza dei punti in cui si è trovata a scorrere acqua piovana o di condensa e quindi l’organismo si è sviluppato maggiormente in concomitanza di tali zone, più ricche d’acqua

7 2. Sintomatologia Iniziale opacizzazione degli strati superficiali, che evolve in un annerimento consistente, causato dalla maturazione e sporulazione del micelio fungino Odore organico caratteristico Nessuna lesione o distruzione dei tessuti (no rugginosità) Interferenza sul normale sviluppo dei frutti (caratteristiche organolettiche) I sintomi si evidenziano soprattutto su Golden Delicious, ma risultano sintomatiche anche altre cultivar (Golden Lasa, Gold Rush, Brina, Summerfree)

8 Bins con mele sintomatiche
2. Sintomatologia In genere si riscontra in cella di conservazione: Durante la conservazione in cella frigo, sia in atmosfera controllata (ULO) che non, in condizioni di elevata umidità relativa, i sintomi si manifestano in maniera evidente Le mele sintomatiche nei bins sono disposte in ordine sparso e non come tipicamente avviene per le malattie da conservazione (infezione che inizia in campo) A volte (sulla base dell’andamento stagionale) è possibile riscontrare i sintomi iniziali già in campo, nel periodo estivo Mela sintomatica in campo Bins con mele sintomatiche Mela sintomatica in conservazione

9 2. Sintomatologia Si è potuto osservare una maggiore diffusione della malattia: nelle annate con lunghi periodi piovosi in primavera, seguiti da estati calde in caso di presenza di fitta copertura fogliare sui frutti sviluppatisi nella parte bassa della pianta

10 2. Sintomatologia DOVE CAMPO CELLA FRIGO
CELLA ATMOSFERA CONTROLLATA (ULO) COME POCHI SINTOMI EVIDENTI AUMENTO PROGRESSIVO SINTOMI SIA COME gravità SIA COME INCIDENZA QUANDO DA LUGLIO ALLA RACCOLTA DALLA RACCOLTA FINO ALLA VENDITA

11 2. Diffusione della malattia
Valutazione dei sintomi presenti su mele in campo e in cella di conservazione al fine di stabilire: l’influenza della tipologia di conservazione (cella frigo o atmosfera controllata, ULO) sulla manifestazione dei sintomi l’influenza dei trattamenti effettuati sulla manifestazione dei sintomi l’influenza del regime di coltivazione (biologico o integrato) sulla manifestazione dei sintomi

12 2. Diffusione della malattia
Individuazione aziende e tesi sperimentali Regime Trattamenti Conservazione tesi trattata fino a termine consentito Cella frigo Atmosfera controllata Azienda 1 Integrato Cella frigo tesi non trattata a partire da ingrossamento frutti Atmosfera controllata Azienda 2 tesi trattata in regime convenzionale da inizio ingrossamento frutti Cella frigo Atmosfera controllata Biologico tesi non trattata fino alla raccolta Cella frigo Atmosfera controllata Valutate e catalogate 2101 mele

13 Atmosfera Controllata (ULO)
2. Diffusione della malattia % di superficie colpita dalla malattia in funzione della modalità di conservazione Azienda 1 Integrato Azienda 2 Bio Atmosfera Controllata (ULO) 16% 21% 37% Cella Frigo 20% 17% 33% Significatività n.s Kruskal-Wallis Test (Nonparametric ANOVA) GraphPad InStat version 3.00 L’ incidenza della malattia non è risultata correlata con la tipologia di conservazione

14 2. Diffusione della malattia
% di superficie colpita dalla malattia in funzione dei trattamenti e del regime di coltivazione Azienda 1 integrato Azienda 2 Integrato Bio Trattato 14% 10% 31% Non Trattato 23% 30% 38% Significatività S p <0,001 Kruskal-Wallis Test (Nonparametric ANOVA) GraphPad InStat version 3.00 L’ incidenza della malattia è risultata maggiore: nelle tesi non trattate rispetto a quelle trattate nelle tesi biologiche rispetto a quelle integrate

15 2. Diffusione della malattia
Conclusioni: L’incidenza della malattia non è risultata correlata alla tipologia di conservazione (cella frigo o ULO) L’incidenza della malattia è risultata inferiore nelle tesi trattate, rispetto a quelle in cui i trattamenti sono stati sospesi in primavera o che non sono state sottoposte a trattamenti L’incidenza della malattia è risultata superiore nelle tesi biologiche, rispetto a quelle sottoposte a regime integrato

16 3. Eziologia Applicazione dei POSTULATI DI KOCH
IDENTIFICAZIONE DEL MICRORGANISMO AL MICROSCOPIO OTTICO IDENTIFICAZIONE SINTOMI DELLA MALATTIA IN CAMPO Osservazione dei sintomi tipici e REISOLAMENTO DA MELE INOCULATE ARTIFICIALMENTE Applicazione dei POSTULATI DI KOCH ISOLAMENTO e identificazione dell’ AGENTE PATOGENO INOCULO PATOGENO SU MELE SANE IN LABORATORIO

17 Sviluppo di un unico microrganismo ricorrente
3. Eziologia Isolamento da mele sintomatiche da campo e da cella frigo, su diversi substrati (Potato Dextrose Agar, Potato Carrot Agar, Agar buccia di mela) e diverse metodiche (da porzione di buccia infetta, da raschiatura, da acqua di lavaggio di buccia infetta; incubazione a T° ambiente o T° controllata a 25°C) per isolare tutta la flora microbica presente Sviluppo di un unico microrganismo ricorrente

18 gruppo Alternaria alternata
3. Eziologia Dictiospore di Alternaria al microscopio ottico Identificazione dell’agente causale al microscopio ottico, confermata da riconoscimento presso Istituto di Micologia Olandese (CBS): gruppo Alternaria alternata

19 Verifica dei postulati di Koch:
3. Eziologia Verifica dei postulati di Koch: Inoculo artificiale in laboratorio su mela sana (immersione intere mele in soluzione di spore di Alternaria 2*105 spore/ml, conservazione in cella frigo o a T° ambiente fino a comparsa dei sintomi) Reisolamento su piastra da sintomatologia indotta

20 3. Eziologia Conclusioni:
l’agente causale della malattia è risultato appartenere al genere Alternaria spp. l’applicazione dei Postulati di Koch ha confermato un solo microrganismo fungino quale agente della malattia, sia in campo che nelle celle di conservazione

21 4. Strategia di controllo chimico: agricoltura convenzionale
Capacità inibitoria dei principali fungicidi usati in melicoltura: Cyprodinil (Chorus) Difenconazolo (Score) Fluazinam (Ohayo) Zolfo puro (Thiopron) Pyraclostrobin (Bellis) Boscalid (Cantus) Dodina (Syllit) Penconazolo (Topas) Pyrimethanil (Scala) Metiram (Polyram) Iprodione (Rovral) Captano (Make-up) 2 prove parallele: Inibizione della crescita del micelio di Alternaria Inibizione della capacità germinativa delle spore di Alternaria

22 Inibizione della crescita del micelio di Alternaria:
4. Strategia di controllo chimico: agricoltura convenzionale Inibizione della crescita del micelio di Alternaria: 4 principi attivi sono risultati efficaci: - Difenconazolo (Score) - Iprodione (Rovral) - Penconazolo (Topas) - Cyprodinil (Chorus)

23 Inibizione della capacità germinativa delle spore di Alternaria
4. Strategia di controllo chimico: agricoltura convenzionale Inibizione della capacità germinativa delle spore di Alternaria

24 4. Strategia di controllo chimico: agricoltura convenzionale
Agrofarmaco Riduzione germinazione spore di Alternaria Riduzione crescita micelio di Alternaria Pyrimethanil (Scala) si no Metiram (Polyram) Captano (Make-up) Penconazolo (Topas) Cyprodinil (Chorus) Difenconazolo (Score) Iprodione (Rovral)

25 Penconazolo (Topas) 2% di spore di Alternaria germinate Testimone
Principio attivo Inoculo patogeno 2% di spore di Alternaria germinate Penconazolo (Topas) Inoculo patogeno Testimone Testimone

26 Cyprodinil (Chorus) 15% di spore di Alternaria germinate Testimone
Principio attivo Inoculo patogeno 15% di spore di Alternaria germinate Cyprodinil (Chorus) Inoculo patogeno Testimone Testimone

27 Colonia a 4 giorni di crescita su PCA
4. Strategia di controllo chimico: agricoltura biologica Rame ossicloruro Colonia a 4 giorni di crescita su PCA 17 volte la dose consigliata in etichetta (60 gr/lt) 12 volte la dose consigliata in etichetta (40 gr/lt) 23 volte la dose consigliata in etichetta (80 gr/lt) 29 volte la dose consigliata in etichetta (100 gr/lt)

28 4. Strategia di controllo chimico: agricoltura convenzionale e biologica
Conclusioni: Sono stati individuati alcuni principi attivi in grado di controllare la crescita del micelio e la germinazione delle spore di Alternaria spp., in particolare il Penconazolo e il Cyprodinil sono risultati i più efficaci Il rame ossicloruro, utilizzato nei regimi di agricoltura biologica, non dotato di selettività ed efficace nei confronti di gran parte degli organismi microfungini, non si è dimostrato efficace nei confronti di Alternaria spp.

29 Progetto Ager StayFresh
Inizio progetto: 2011 Il progetto di ricerca AGER STAYFRESH “Strategie innovative rispondenti ai bisogni delle imprese nel comparto degli ortofrutticoli della IV gamma”, si è occupato anche della ricerca di trattamenti fitoiatrici sostenibili, basati sull’utilizzo di antagonisti naturali contro i patogeni vegetali. Attività previste (Task/activities): Ricerca di antagonisti naturali contro malattie di post-raccolta su mela Applicazione di antagonisti naturali e monitoraggio su mela (+) Caratterizzazione dell’agente causale della malattia

30 Caratterizzazione dell’agente causale
Valutazione della possibile variabilità genetica (caratterizzazione molecolare) del patogeno, a causa della difficoltà del riconoscimento morfologico delle specie di Alternaria «small-spored» (Polizzotto et al., 2012): Analisi molecolari su 41 ceppi di Alternaria spp. isolati da mele sintomatiche: Estrazione del DNA da micelio fungino Amplificazione della regione ITS (Internal Transcribed Spacer) con tecniche di PCR-RFLP Confronto con i profili di restrizione dei ceppi di riferimento di A. alternata, A. arborescens e A. tenuissima A. arborescens A. alternata

31 Caratterizzazione dell’agente causale
Analisi molecolari su 41 ceppi di Alternaria spp. isolati da mele sintomatiche: A. arborescens A. arborescens A. alternata A. alternata Amplificazione della regione IGS (Intergenic Spacer) con tecniche PCR-RFLP Confronto con i profili di restrizione dei ceppi di riferimento di A. alternata, A. arborescens e A. tenuissima

32 Caratterizzazione dell’agente causale
Caratterizzazione morfologica su 41 ceppi di Alternaria spp. isolati da mele sintomatiche: osservazione delle colonie su terreni Potato Carrot Agar e DRYES A. arborescens A. alternata Tot: 17 ceppi A. arborescens, 24 ceppi A. alternata

33 Ripetizione prova di patogenicità: inoculo patogeno su mela sana
Caratterizzazione dell’agente causale Ripetizione prova di patogenicità: inoculo patogeno su mela sana mele sterilizzate in superficie con esposizione a raggi UV-C (UNIUD-DIAL, 10’ per lato, λ 254 nm) individuati 6 spot per ciascuna mela, in 3 diverse posizioni (calice, peduncolo, equatore) e inoculati con una soluzione di spore (2*105 spore/ml) di Alternaria arborescens (3 ceppi diversi) e Alternaria alternata (3 ceppi diversi) valutazione dello sviluppo dei sintomi tipici della malattia (fumaggine nerastra) a T ambiente e a 0°C

34 Spot sintomatici alla fine della prova (30 dpi a T° amb, 80 dpi a 0°C)
Caratterizzazione dell’agente causale Spot sintomatici alla fine della prova (30 dpi a T° amb, 80 dpi a 0°C) Percentuale di spot con sintomi Spot sintomatico, a occhio nudo e allo stereomicroscopio

35 Caratterizzazione dell’agente causale
Conclusioni: Sono stati isolati diversi ceppi fungini associati alla sintomatologia descritta e appartenenti al gruppo di Alternaria alternata In particolare, sono stati identificati 24 ceppi di A. alternata e ceppi di A. arborescens Le prove di patogenicità effettuate hanno permesso di stabilire che A. arborescens è in grado di provocare sintomi identici a quelli osservati in campo A. alternata invece ha manifestato una minor virulenza, con sintomi più lievi e assenza del caratteristico odore organico La valutazione dei sintomi ad occhio nudo è risultata spesso difficoltosa (necessità di uso dello stereomicroscopio)

36 Ricerca degli antagonisti:
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti Ricerca degli antagonisti: 90 isolamenti da mele asintomatiche in cella frigo

37 Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
73 isolati tra lieviti e funghi utilizzati per prove di antagonismo preliminari in vitro contro Alternaria spp. Alternaria ORGANISMI EFFICACI antagonista ORGANISMI NON EFFICACI

38 Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
57 microrganismi sono risultati in grado di ostacolare la crescita del patogeno

39 Identificazione degli antagonisti:
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti Identificazione degli antagonisti: Suddivisione morfologica Estrazione rapida del DNA genomico fungino PCR-RFLP Sequenziamento e confronto in GenBank

40 Identificazione degli antagonisti:
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti Identificazione degli antagonisti: N°di colonie ottenute dagli isolamenti

41 Azione degli antagonisti: Prove di antagonismo in vitro a T° ambiente
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti Azione degli antagonisti: Prove di antagonismo in vitro a T° ambiente per : Aureobasidium Cryptosporiopsis Acremonium Alternaria (controllo)

42 (temperatura ambiente)
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti Crescita della colonia di Alternaria (in mm) in presenza degli antagonisti (temperatura ambiente) Diametro della colonia in mm

43 Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
Azione degli antagonisti: Prove di antagonismo in vitro in cella frigorifera (≈ 0°C) per : Aureobasidium Cryptosporiopsis Acremonium Alternaria (controllo)

44 Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
Crescita della colonia di Alternaria (in mm) in presenza degli antagonisti (0°C) Diametro della colonia in mm

45 Analisi molecolari su 27 ceppi isolati di Aureobasidium spp.:
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti Analisi molecolari su 27 ceppi isolati di Aureobasidium spp.: Analisi della porzione ITS nessuna differenza evidenziabile Analisi con tecniche di rep-PCR suddivisione in circa 10 gruppi molecolari Le sequenze ottenute dalla porzione ITS di 2 ceppi rappresentativi hanno mostrato una similarità di sequenza del 100% con la sequenza di A. pullulans var. pullulans strain CBS (accession number FJ150906) presenti in banca dati

46 Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
Verifica dell’azione antagonistica in vitro di ciascun gruppo nei confronti di diversi ceppi di Alternaria spp. (3 A. arborescens + 3 A. alternata) A B A B Azione antagonista di A. pullulans (A) nei confronti di A. arborescens (B) Azione antagonista di A. pullulans (A) nei confronti di A. alternata (B) A. pullulans è risultato svolgere una valida azione antagonista nei confronti di A. arborescens, mentre non è risultato molto efficace nei confronti di A. alternata Scelta di 4 ceppi rappresentativi di A. pullulans da usare nelle prove di antagonismo in vivo su mele frigoconservate:

47 Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
Conclusioni: Sono stati isolati diversi organismi con azione antagonistica nei confronti di Alternaria spp. Gli organismi rivelatisi maggiormente efficaci (appartenenti a 3 diversi generi) sono stati utilizzati per prove di antagonismo a temperatura ambiente e a circa 0°C (t delle celle di conservazione) e hanno mostrato di ostacolare in maniera significativa la crescita del patogeno in entrambe le condizioni di temperatura Gli organismi isolati appartenevano principalmente (27 su 57) alla specie Aureobasidium pullulans, appartenenti a 10 gruppi molecolari L’azione antagonistica è risultata più efficace nei confronti di A. arborescens che nei confronti di A. alternata 4 ceppi di A. pullulans più efficaci in vitro sono stati scelti per prove in vivo

48 Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre-harvest
Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens: individuazione a Maggio di un meleto da condurre senza trattamenti fungicidi preparazione di una soluzione di cellule di Aureobasidium pullulans ceppi ad una concentrazione finale di 2* 108 CFU/ml 10 piante trattate ciascuna con 500 ml della soluzione ottenuta, distribuita con atomizzatore sull’intera chioma 4 trattamenti durante la stagione: ; ; ; raccolta mele da 10 piante trattate (circa 1000 frutti) e da 10 non trattate (circa 800 frutti) (controllo negativo) il individuati 6 spot per ciascuna mela in 3 diverse posizioni con le stesse modalità utilizzate per la prova di patogenicità, inoculati con una soluzione di spore di Alternaria arborescens (2*105 spore/ml) valutazione dello sviluppo dei sintomi tipici della malattia (fumaggine nerastra) in presenza o assenza dell’antagonista, su mele conservate in ambiente con bassa umidità relativa a T° ambiente e a 0°C

49 Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in post-harvest
Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens: mele non trattate inoculate per immersione in una soluzione di cellule di Aureobasidium pullulans (5*108 cfu/ml) individuati 6 spot per ciascuna mela, in 3 diverse posizioni e con le stesse modalità utilizzate per la prova di patogenicità, e inoculati con una soluzione di spore di Alternaria arborescens (2*105 spore/ml) valutazione dello sviluppo dei sintomi tipici della malattia (fumaggine nerastra) in presenza o assenza dell’antagonista, su mele conservate in ambiente con elevata umidità relativa a T° ambiente e a 0°C

50 Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens a T° ambiente
Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre- e post-harvest Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens a T° ambiente Percentuale di spot con sintomi Comparsa dei primi sintomi (15 dpi) Fine prova (40 dpi) Fisher’s exact test: P < , estremamente significativo

51 Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti
in pre- e post-harvest Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens in cella frigorifera Percentuale di spot con sintomi Comparsa dei primi sintomi (120 dpi) Fine prova (200 dpi) Fisher’s exact test: P < , estremamente significativo

52 Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre- e post-harvest
Conclusioni: Sono stati effettuati trattamenti per verificare la capacità dell’antagonista di contenere la malattia, in pre-raccolta, con buoni risultati ma con alcune criticità: si sono manifestati leggeri sintomi a carico delle foglie (piccole necrosi fogliari), dovuti probabilmente alla eccessiva quantità di cellule di A. pullulans utilizzate ed alla modalità di trattamento si sono osservati dei sintomi di fumaggine (provocata da A. pullulans e diversa da quella causata da A. arborescens) durante la conservazione, nelle porzioni maggiormente umide Sarà necessario mettere a punto i trattamenti, con una minore quantità di spore per ottimizzare l’azione dell’antagonista, e trovando il momento ideale per l’applicazione

53 Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre- e post-harvest
Conclusioni: Sono stati effettuati trattamenti per verificare la capacità dell’antagonista di contenere la malattia quando utilizzato in post- raccolta, con ottimi risultati Aureobasidium pullulans si è dimostrato un organismo di biocontrollo efficace anche nei confronti della fumaggine del melo