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Strategie di difesa con agenti di biocontrollo in pre- e post-harvest … … contro la «fumaggine» causata da Alternaria spp. Moruzzi Serena, Martini Marta.

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1 Strategie di difesa con agenti di biocontrollo in pre- e post-harvest … … contro la «fumaggine» causata da Alternaria spp. Moruzzi Serena, Martini Marta Università degli Studi di Udine, DISA

2 Presentazione del problema 2000 : prime segnalazioni in FVG di alterazioni della buccia delle mele in campo e in ambiente di conservazione Presenza di fumaggine Presenza di agenti fungini Diagnosi di routine Osservazione dei sintomi Indagini fitopatologiche (stereomicroscopio e isolamento)

3 Presentazione del problema 2008: Università di Udine, DISA (p.a. Borselli S., prof. Osler R., dott. Grisan S., dott. Poggetti L.) Agenzia Regionale per lo Sviluppo Rurale (dott. Benvenuto L., dott. Malossini G., dott. Frausin C.) FriulFruct (dott. Zampa C.) 1. Ricerca bibliografica 2. Sintomatologia e diffusione della malattia: campo e ambiente di conservazione 3. Eziologia della malattia (identificazione agente/i patogeno/i): isolamento microrganismi e loro identificazione, postulati di Koch 4. Individuazione strategia di lotta/controllo: chimico biologico hanno iniziato progetto di ricerca sulla malattia:

4 1. Ricerca bibliografica - Problematiche simili (malattie epifitiche) risultavano comuni nelle zone temperate e umide: diffuse in gran parte degli Stati Uniti, Europa (Olanda, Norvegia, Germania, Slovenia, Serbia, Polonia), Turchia, Giappone, Cina, Brasile -In Italia segnalazioni in Trentino Alto Adige, Piemonte, Emilia Romagna e Friuli Venezia Giulia (Lindner, 2009; Grosso et al., 2011) Malattia - Gloeodes pomigena (Schweinitz, 1832) - Peltaster fructicola (Johnson et al., 1997) - Leptodontium elatius (Johnson et al., 1997) - Geastrumia polystigmatis (Johnson et al., 1997) - 80 nuove presunte specie (anni 2000), tra cui : Tripospermum spp. (Grabowski, 2007); Microcyclospora spp., Stomiopeltis spp., Microcyclosporella spp. (Gleason et al., 2011) Classe Dothideomycetes, ordine Capnodiales (95%) Sooty blotch (maculatura fuligginosa) Agenti causali

5 Malattia - Schizothyrium pomi (Von Arx, 1959) - Zygophiala jamaicensis (Mason, 1945) - 10 nuove presunte specie (anni 2000), tra cui: Ramularia spp., Dissoconium spp. (Gleason et al., 2011) Flyspeck (macchiolina di mosca) - Tilletiopsis spp. (Boekhout et al., 2006) White haze (patina bianca) Agenti causali 1. Ricerca bibliografica

6 2. Sintomatologia Tipica delle malattie epifitiche (fumaggini) che si sviluppano a spese degli strati più superficiali e inerti del frutto: Striature diffuse sulla maggior parte della superficie del frutto, concentrate soprattutto (colore nero più intenso) nei dintorni della base del peduncolo e della depressione calicina; frequentemente sembrano descrivere il percorso di un percolamento, probabilmente in corrispondenza dei punti in cui si è trovata a scorrere acqua piovana o di condensa e quindi l’organismo si è sviluppato maggiormente in concomitanza di tali zone, più ricche d’acqua

7 2. Sintomatologia Iniziale opacizzazione degli strati superficiali, che evolve in un annerimento consistente, causato dalla maturazione e sporulazione del micelio fungino Odore organico caratteristico Nessuna lesione o distruzione dei tessuti (no rugginosità) Interferenza sul normale sviluppo dei frutti (caratteristiche organolettiche) I sintomi si evidenziano soprattutto su Golden Delicious, ma risultano sintomatiche anche altre cultivar (Golden Lasa, Gold Rush, Brina, Summerfree)

8 In genere si riscontra in cella di conservazione : Durante la conservazione in cella frigo, sia in atmosfera controllata (ULO) che non, in condizioni di elevata umidità relativa, i sintomi si manifestano in maniera evidente Le mele sintomatiche nei bins sono disposte in ordine sparso e non come tipicamente avviene per le malattie da conservazione (infezione che inizia in campo) A volte (sulla base dell’andamento stagionale) è possibile riscontrare i sintomi iniziali già in campo, nel periodo estivo 2. Sintomatologia Mela sintomatica in campoMela sintomatica in conservazioneBins con mele sintomatiche

9 Si è potuto osservare una maggiore diffusione della malattia: nelle annate con lunghi periodi piovosi in primavera, seguiti da estati calde in caso di presenza di fitta copertura fogliare sui frutti sviluppatisi nella parte bassa della pianta 2. Sintomatologia

10 DOVECAMPOCELLA FRIGOCELLA ATMOSFERA CONTROLLATA (ULO) COMEPOCHI SINTOMI EVIDENTI AUMENTO PROGRESSIVO SINTOMI SIA COME GRAVITÀ SIA COME INCIDENZA QUANDODA LUGLIO ALLA RACCOLTA DALLA RACCOLTA FINO ALLA VENDITA 2. Sintomatologia

11 Valutazione dei sintomi presenti su mele in campo e in cella di conservazione al fine di stabilire :  l’influenza della tipologia di conservazione (cella frigo o atmosfera controllata, ULO) sulla manifestazione dei sintomi  l’influenza dei trattamenti effettuati sulla manifestazione dei sintomi  l’influenza del regime di coltivazione (biologico o integrato) sulla manifestazione dei sintomi 2. Diffusione della malattia

12 Individuazione aziende e tesi sperimentali Integrato Biologico tesi trattata fino a termine consentito tesi non trattata a partire da ingrossamento frutti TrattamentiRegimeConservazione Cella frigo Atmosfera controllata Cella frigo Atmosfera controllata tesi trattata in regime convenzionale da inizio ingrossamento frutti Cella frigo Atmosfera controllata tesi non trattata fino alla raccolta Cella frigo Atmosfera controllata Valutate e catalogate 2101 mele Azienda 1 Azienda 2 2. Diffusione della malattia

13 % di superficie colpita dalla malattia in funzione della modalità di conservazione Azienda 1 Integrato Azienda 2 Integrato Azienda 2 Bio Atmosfera Controllata ( ULO) 16%21%37% Cella Frigo20%17%33% Significativitàn.s Kruskal-Wallis Test (Nonparametric ANOVA) GraphPad InStat version 3.00 L’ incidenza della malattia non è risultata correlata con la tipologia di conservazione 2. Diffusione della malattia

14 L’ incidenza della malattia è risultata maggiore: -nelle tesi non trattate rispetto a quelle trattate -nelle tesi biologiche rispetto a quelle integrate % di superficie colpita dalla malattia in funzione dei trattamenti e del regime di coltivazione Azienda 1 integrato Azienda 2 Integrato Azienda 2 Bio Trattato14%10%31% Non Trattato23% 30%38% SignificativitàS p <0,001 Kruskal-Wallis Test (Nonparametric ANOVA) GraphPad InStat version Diffusione della malattia

15 Conclusioni:  L’incidenza della malattia non è risultata correlata alla tipologia di conservazione (cella frigo o ULO)  L’incidenza della malattia è risultata inferiore nelle tesi trattate, rispetto a quelle in cui i trattamenti sono stati sospesi in primavera o che non sono state sottoposte a trattamenti  L’incidenza della malattia è risultata superiore nelle tesi biologiche, rispetto a quelle sottoposte a regime integrato 2. Diffusione della malattia

16 IDENTIFICAZIONE SINTOMI DELLA MALATTIA IN CAMPO ISOLAMENTO E IDENTIFICAZIONE DELL’ AGENTE PATOGENO IDENTIFICAZIONE DEL MICRORGANISMO AL MICROSCOPIO OTTICO INOCULO PATOGENO SU MELE SANE IN LABORATORIO OSSERVAZIONE DEI SINTOMI TIPICI E REISOLAMENTO DA MELE INOCULATE ARTIFICIALMENTE Applicazione dei POSTULATI DI KOCH 3. Eziologia

17 Isolamento da mele sintomatiche da campo e da cella frigo, su diversi substrati (Potato Dextrose Agar, Potato Carrot Agar, Agar buccia di mela) e diverse metodiche (da porzione di buccia infetta, da raschiatura, da acqua di lavaggio di buccia infetta; incubazione a T° ambiente o T° controllata a 25°C) per isolare tutta la flora microbica presente Sviluppo di un unico microrganismo ricorrente 3. Eziologia

18 Dictiospore di Alternaria al microscopio ottico Identificazione dell’agente causale al microscopio ottico, confermata da riconoscimento presso Istituto di Micologia Olandese (CBS): gruppo Alternaria alternata 3. Eziologia

19 Reisolamento su piastra da sintomatologia indotta Inoculo artificiale in laboratorio su mela sana (immersione intere mele in soluzione di spore di Alternaria 2*10 5 spore/ml, conservazione in cella frigo o a T° ambiente fino a comparsa dei sintomi) 3. Eziologia Verifica dei postulati di Koch:

20 3. Eziologia Conclusioni:  l’agente causale della malattia è risultato appartenere al genere Alternaria spp.  l’applicazione dei Postulati di Koch ha confermato un solo microrganismo fungino quale agente della malattia, sia in campo che nelle celle di conservazione

21 4. Strategia di controllo chimico: agricoltura convenzionale Dodina (Syllit) Penconazolo (Topas) Pyrimethanil (Scala) Metiram (Polyram) Iprodione (Rovral) Captano (Make-up) Cyprodinil (Chorus) Difenconazolo (Score) Fluazinam (Ohayo) Zolfo puro (Thiopron) Pyraclostrobin (Bellis) Boscalid (Cantus) Capacità inibitoria dei principali fungicidi usati in melicoltura: Inibizione della crescita del micelio di Alternaria Inibizione della capacità germinativa delle spore di Alternaria 2 prove parallele:

22 4 principi attivi sono risultati efficaci: - Difenconazolo (Score) - Iprodione (Rovral) - Penconazolo (Topas) - Cyprodinil (Chorus) Inibizione della crescita del micelio di Alternaria: 4. Strategia di controllo chimico: agricoltura convenzionale

23 Inibizione della capacità germinativa delle spore di Alternaria 4. Strategia di controllo chimico: agricoltura convenzionale

24 Agrofarmaco Riduzione germinazione spore di Alternaria Riduzione crescita micelio di Alternaria Pyrimethanil (Scala)sino Metiram (Polyram)sino Captano (Make-up)sino Penconazolo (Topas)si Cyprodinil (Chorus)si Difenconazolo (Score)nosi Iprodione (Rovral)nosi 4. Strategia di controllo chimico: agricoltura convenzionale

25 Penconazolo (Topas) 2% di spore di Alternaria germinate Principio attivo Inoculo patogeno Inoculo patogeno Testimone

26 Cyprodinil (Chorus) 15% di spore di Alternaria germinate Principio attivo Inoculo patogeno Inoculo patogeno Testimone

27 23 volte la dose consigliata in etichetta (80 gr/lt) 12 volte la dose consigliata in etichetta (40 gr/lt) Colonia a 4 giorni di crescita su PCA 29 volte la dose consigliata in etichetta (100 gr/lt) 17 volte la dose consigliata in etichetta (60 gr/lt) Rame ossicloruro 4. Strategia di controllo chimico: agricoltura biologica

28 Conclusioni:  Sono stati individuati alcuni principi attivi in grado di controllare la crescita del micelio e la germinazione delle spore di Alternaria spp., in particolare il Penconazolo e il Cyprodinil sono risultati i più efficaci  Il rame ossicloruro, utilizzato nei regimi di agricoltura biologica, non dotato di selettività ed efficace nei confronti di gran parte degli organismi microfungini, non si è dimostrato efficace nei confronti di Alternaria spp. 4. Strategia di controllo chimico: agricoltura convenzionale e biologica

29 Inizio progetto: 2011 Il progetto di ricerca AGER STAYFRESH “Strategie innovative rispondenti ai bisogni delle imprese nel comparto degli ortofrutticoli della IV gamma”, si è occupato anche della ricerca di trattamenti fitoiatrici sostenibili, basati sull’utilizzo di antagonisti naturali contro i patogeni vegetali. Attività previste (Task/activities): Progetto Ager StayFresh Ricerca di antagonisti naturali contro malattie di post-raccolta su mela Applicazione di antagonisti naturali e monitoraggio su mela (+) Caratterizzazione dell’agente causale della malattia

30 Valutazione della possibile variabilità genetica (caratterizzazione molecolare) del patogeno, a causa della difficoltà del riconoscimento morfologico delle specie di Alternaria «small- spored» (Polizzotto et al., 2012): Analisi molecolari su 41 ceppi di Alternaria spp. isolati da mele sintomatiche: Caratterizzazione dell’agente causale Estrazione del DNA da micelio fungino Amplificazione della regione ITS (Internal Transcribed Spacer) con tecniche di PCR-RFLP Confronto con i profili di restrizione dei ceppi di riferimento di A. alternata, A. arborescens e A. tenuissima A. alternata A. arborescens

31 Amplificazione della regione IGS (Intergenic Spacer) con tecniche PCR-RFLP Confronto con i profili di restrizione dei ceppi di riferimento di A. alternata, A. arborescens e A. tenuissima Caratterizzazione dell’agente causale Analisi molecolari su 41 ceppi di Alternaria spp. isolati da mele sintomatiche: A. arborescens A. alternata

32 Caratterizzazione morfologica su 41 ceppi di Alternaria spp. isolati da mele sintomatiche: osservazione delle colonie su terreni Potato Carrot Agar e DRYES A. arborescensA. alternata Caratterizzazione dell’agente causale Tot: 17 ceppi A. arborescens, 24 ceppi A. alternata

33 Ripetizione prova di patogenicità: inoculo patogeno su mela sana  mele sterilizzate in superficie con esposizione a raggi UV-C (UNIUD-DIAL, 10’ per lato, λ 254 nm)  individuati 6 spot per ciascuna mela, in 3 diverse posizioni (calice, peduncolo, equatore) e inoculati con una soluzione di spore (2*10 5 spore/ml) di Alternaria arborescens (3 ceppi diversi) e Alternaria alternata (3 ceppi diversi)  valutazione dello sviluppo dei sintomi tipici della malattia (fumaggine nerastra) a T ambiente e a 0°C Caratterizzazione dell’agente causale

34 Spot sintomatici alla fine della prova (30 dpi a T° amb, 80 dpi a 0°C) Percentuale di spot con sintomi Spot sintomatico, a occhio nudo e allo stereomicroscopio Caratterizzazione dell’agente causale

35 Conclusioni:  Sono stati isolati diversi ceppi fungini associati alla sintomatologia descritta e appartenenti al gruppo di Alternaria alternata  In particolare, sono stati identificati 24 ceppi di A. alternata e 17 ceppi di A. arborescens  Le prove di patogenicità effettuate hanno permesso di stabilire che A. arborescens è in grado di provocare sintomi identici a quelli osservati in campo  A. alternata invece ha manifestato una minor virulenza, con sintomi più lievi e assenza del caratteristico odore organico  La valutazione dei sintomi ad occhio nudo è risultata spesso difficoltosa (necessità di uso dello stereomicroscopio) Caratterizzazione dell’agente causale

36 Ricerca degli antagonisti: 90 isolamenti da mele asintomatiche in cella frigo Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti

37 73 isolati tra lieviti e funghi utilizzati per prove di antagonismo preliminari in vitro contro Alternaria spp. ORGANISMI EFFICACI ORGANISMI NON EFFICACI Alternaria antagonista Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti

38 57 microrganismi sono risultati in grado di ostacolare la crescita del patogeno Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti

39 Identificazione degli antagonisti: Suddivisione morfologica Estrazione rapida del DNA genomico fungino PCR-RFLP Sequenziamento e confronto in GenBank Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti

40 Identificazione degli antagonisti: N°di colonie ottenute dagli isolamenti Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti

41 Azione degli antagonisti: Prove di antagonismo in vitro a T° ambiente per : Aureobasidium Cryptosporiopsis Acremonium Alternaria (controllo) Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti

42 Crescita della colonia di Alternaria (in mm) in presenza degli antagonisti (temperatura ambiente) Diametro della colonia in mm Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti

43 Azione degli antagonisti: Prove di antagonismo in vitro in cella frigorifera (≈ 0°C) per : Aureobasidium Cryptosporiopsis Acremonium Alternaria (controllo) Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti

44 Crescita della colonia di Alternaria (in mm) in presenza degli antagonisti (0°C) Diametro della colonia in mm Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti

45  Analisi della porzione ITS nessuna differenza evidenziabile Analisi molecolari su 27 ceppi isolati di Aureobasidium spp.: Le sequenze ottenute dalla porzione ITS di 2 ceppi rappresentativi hanno mostrato una similarità di sequenza del 100% con la sequenza di A. pullulans var. pullulans strain CBS (accession number FJ150906) presenti in banca dati Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti  Analisi con tecniche di rep-PCR suddivisione in circa 10 gruppi molecolari

46 Verifica dell’azione antagonistica in vitro di ciascun gruppo nei confronti di diversi ceppi di Alternaria spp. (3 A. arborescens + 3 A. alternata) Azione antagonista di A. pullulans (A) nei confronti di A. arborescens (B) Azione antagonista di A. pullulans (A) nei confronti di A. alternata (B) A. pullulans è risultato svolgere una valida azione antagonista nei confronti di A. arborescens, mentre non è risultato molto efficace nei confronti di A. alternata AA BB AA B B Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti Scelta di 4 ceppi rappresentativi di A. pullulans da usare nelle prove di antagonismo in vivo su mele frigoconservate:

47 Conclusioni:  Sono stati isolati diversi organismi con azione antagonistica nei confronti di Alternaria spp.  Gli organismi rivelatisi maggiormente efficaci (appartenenti a 3 diversi generi) sono stati utilizzati per prove di antagonismo a temperatura ambiente e a circa 0°C (t delle celle di conservazione) e hanno mostrato di ostacolare in maniera significativa la crescita del patogeno in entrambe le condizioni di temperatura  Gli organismi isolati appartenevano principalmente (27 su 57) alla specie Aureobasidium pullulans, appartenenti a 10 gruppi molecolari  L’azione antagonistica è risultata più efficace nei confronti di A. arborescens che nei confronti di A. alternata  4 ceppi di A. pullulans più efficaci in vitro sono stati scelti per prove in vivo Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti

48 Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre-harvest Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens:  individuazione a Maggio di un meleto da condurre senza trattamenti fungicidi  preparazione di una soluzione di cellule di Aureobasidium pullulans ceppi ad una concentrazione finale di 2* 10 8 CFU/ml  10 piante trattate ciascuna con 500 ml della soluzione ottenuta, distribuita con atomizzatore sull’intera chioma  4 trattamenti durante la stagione : ; ; ;  raccolta mele da 10 piante trattate (circa 1000 frutti) e da 10 non trattate (circa 800 frutti) (controllo negativo) il  individuati 6 spot per ciascuna mela in 3 diverse posizioni con le stesse modalità utilizzate per la prova di patogenicità, inoculati con una soluzione di spore di Alternaria arborescens (2*10 5 spore/ml)  valutazione dello sviluppo dei sintomi tipici della malattia (fumaggine nerastra) in presenza o assenza dell’antagonista, su mele conservate in ambiente con bassa umidità relativa a T° ambiente e a 0°C

49 Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens :  mele non trattate inoculate per immersione in una soluzione di cellule di Aureobasidium pullulans (5*10 8 cfu/ml)  individuati 6 spot per ciascuna mela, in 3 diverse posizioni e con le stesse modalità utilizzate per la prova di patogenicità, e inoculati con una soluzione di spore di Alternaria arborescens (2*10 5 spore/ml)  valutazione dello sviluppo dei sintomi tipici della malattia (fumaggine nerastra) in presenza o assenza dell’antagonista, su mele conservate in ambiente con elevata umidità relativa a T° ambiente e a 0°C Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in post-harvest

50 Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens a T° ambiente Comparsa dei primi sintomi (15 dpi)Fine prova (40 dpi) Percentuale di spot con sintomi Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre- e post-harvest Fisher’s exact test: P < , estremamente significativo

51 Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens in cella frigorifera Comparsa dei primi sintomi (120 dpi)Fine prova (200 dpi) Percentuale di spot con sintomi Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre- e post-harvest Fisher’s exact test: P < , estremamente significativo

52 Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre- e post-harvest Conclusioni:  Sono stati effettuati trattamenti per verificare la capacità dell’antagonista di contenere la malattia, in pre-raccolta, con buoni risultati ma con alcune criticità: si sono manifestati leggeri sintomi a carico delle foglie (piccole necrosi fogliari), dovuti probabilmente alla eccessiva quantità di cellule di A. pullulans utilizzate ed alla modalità di trattamento si sono osservati dei sintomi di fumaggine (provocata da A. pullulans e diversa da quella causata da A. arborescens) durante la conservazione, nelle porzioni maggiormente umide  Sarà necessario mettere a punto i trattamenti, con una minore quantità di spore per ottimizzare l’azione dell’antagonista, e trovando il momento ideale per l’applicazione

53 Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre- e post-harvest Conclusioni:  Sono stati effettuati trattamenti per verificare la capacità dell’antagonista di contenere la malattia quando utilizzato in post- raccolta, con ottimi risultati  Aureobasidium pullulans si è dimostrato un organismo di biocontrollo efficace anche nei confronti della fumaggine del melo


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