La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI Corso di Laurea Magistrale in Neurobiologia EFFETTI DELLA PROTEINA RICOMBINANTE MnSOD IN MODELLI IN.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI Corso di Laurea Magistrale in Neurobiologia EFFETTI DELLA PROTEINA RICOMBINANTE MnSOD IN MODELLI IN."— Transcript della presentazione:

1 FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI Corso di Laurea Magistrale in Neurobiologia EFFETTI DELLA PROTEINA RICOMBINANTE MnSOD IN MODELLI IN VIVO E IN VITRO DI IN MODELLI IN VIVO E IN VITRO DI INVECCHIAMENTO E NEURODEGENERAZIONE INVECCHIAMENTO E NEURODEGENERAZIONE Anno Accademico Candidata Maria Lo Giudice matricola: Correlatore Annamaria Confaloni Relatore Giancarlo Poiana

2 SOD= SUPEROSSIDODISMUTASI: tra i più importanti enzimi antiossidanti, presenti in tutte le cellule che metabolizzano l’O 2. 3 isoforme Cu, Zn-SOD SOD citosolica- nucleo, spazio mitocondriale intermembrana lisosomi, perossisomi. Mn-SOD SOD mitocondriale- matrice mitocondriale. Cu, Zn-SOD SOD extracellulare

3 rMnSOD: LSA-type MnSOD identificata in vescicole secrete da cellule LSA e ottenuta in forma ricombinante (Mancini et al., 2006). Azione enzimatica comune a tutte le SOD e particolari proprietà strutturali e funzionali: Localizzazione: mitocondrio, RER, vescicole secretorie. Struttura : sequenza leader Contiene la sequenza leader all’N- terminale, ritenuta responsabile dell’internalizzazione della proteina nelle cellule (Borrelli et al., 2011). Applicazioni: Funzione antiossidante Azione anti-tumorale (Pica et al., 2010) Effetto radio-protettivo (Borrelli et al., 2009) Azione protettiva nella cirrosi epatica (Guillaume et al., 2013) Promettenti potenzialità Sistema nervoso….

4 INVECCHIAMENTO CEREBRALE NEURODEGENERAZIONE Graduale e fisiologica modificazione strutturale e funzionale, del cervello, spesso associata a gradi variabili di declino cognitivo. Fenomeno patologico consistente nella progressiva perdita di funzione o morte di neuroni e/o cellule accessorie, con conseguente compromissione dell’intero sistema nervoso. In quali condizioni del SN? Stress ossidativo Neuroinfiammazione Morte cellulare In quali condizioni del SN? Mn-SOD Coinvolgimento della SOD2 in patologie neurodegenerative (AD, PD, SLA) e nel “normale” declino cognitivo età-correlato (Flynn et al., 2013). L’overespressione di SOD2 contrasta lo stress ossidativo, la morte neuronale e l’infiammazione indotti da diversi stimoli neurodegenerativi (Holley et al., 2011).

5 STRESS OSSIDATIVO: ECCESSO DI ROS NEUROINFIAMMAZIONE Mn-SOD MORTE CELLULARE MnSOD possiede un ruolo protettivo dall’induzione dell’apoptosi innescata dal TNF- α. (Delhalle et al., 2002) MnSOD previene il rilascio dal mitocondrio di fattori pro-apoptotici come il citocromo c. (Holley et al., 2011) MnSOD opera la neutralizzazione dell’O 2 ·-. (Fukui et al., 2010)

6 TESTARE L’EFFETTO DELLA rMnSOD Modello in vivo di invecchiamento Stress ossidativo Neuroinfiammazione Morte cellulare Scopo della ricerca Modello in vitro di neurodegenerazione Analisi comportamentaleAnalisi cellulareAnalisi biochimica

7 Modello IN VIVO 18 topi C57/BL maschi, di 18 mesi, divisi in 2 gruppi per il trattamento cronico di 10 giorni con la proteina ricombinante o la soluzione salina. 9 topi, Trattati, sottoposti a trattamento intranasale con la rMnSOD 4,5 µM. 9 topi, Ctrl, sottoposti a trattamento intranasale con la soluzione salina. Al termine del trattamento…. Materali e metodi

8 Analisi comportamentale: Fear conditioning Training : tone + shock BaselinePause 3 min 90’’30’’ 2’’ 5 min 4 min 2’’ 90’’30’’ Materali e metodi

9 Analisi biochimica : valutazione dell’espressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali. MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine: BLC, CD30L, Eotaxin, Eotaxin-2, Fas Ligand, Fractalkine, GCSF, GM-CSF, IFNγ, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 p40/p70, IL-12 p70, IL-13, IL-17, I-TAC, KC/CXCL1, Leptin/OB, LIX, Lymphotactin, MCP-1, MCSF, MIG, MIP-1α, MIP-1γ, RANTES, SDF-1, TCA-3, TECK, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α, sTNF-RI, sTNF-RII. Mediante una reazione antigene/anticorpo, il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione. Cx trattatoCx Ctrl Materali e metodi

10 Risultati modello in vivo

11 FEAR CONDITIONING: 4 Parametri: Freezing Grooming Not moving Crossing/min Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dell’attività locomotoria sia nel tone che nel context retest => nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali.

12 MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY Risultati Diminuzione per:  IL-1β: -33% (p<0,01).  IL-2: -20% (p<0,05).  TNFα: -29% (p<0,05).  sTNF-R2: -14% (p<0,05).

13 MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY Risultati Tendenza a diminuire per:  l’IL-1α: -15% (p= 0,09).  l’IL-3: -30% (p= 0,07).  I-TAC: -25% (p= 0,09).  LIX: -13% (p= 0,07). Tendenza ad aumentare per:  MIP-1γ: +20% (p= 0,06).

14 Il trattamento con la rMnSOD 0,75 μ M induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare. - rMnSOD+ rMnSOD 0,75 μM 3h+ rMnSOD 0,75 μM 6h Conferma dell’azione anti-tumorale della rMnSOD, già descritta in letteratura (Mancini et al., 2008), estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa. Modello in vitro Cellule di neuroblastoma SK-N-BE

15 Modello in vitro Le cellule SK-N-BE, dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μ M fenotipo neuron-like Le cellule SK-N-BE, dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μ M, sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose, mostrando un fenotipo neuron-like. Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo Menadione induttore del radicale O2·- nei mitocondri, causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale. Glutammato induttore di eccitotossicità. Materali e metodi

16  Trattamento 20 h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD. Conferma dell’avvenuto differenziamento e della non tossicità della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate.  Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento: IMMUNOCITOCHIMICA Risultati % vitalità cellulare rispetto al Ctrl ** MTT

17 Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a: Trattamento con menadioneTrattamento con glutammato Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2’,7’- Dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCDHF-DA Valutazione della vitalità cellulare mediante il saggio dell’MTT Materali e metodi +rMnSOD 0,75 μ M 1h +menadione 25 o 50 μ M 1h 20h +rMnSOD 0,75 μ M +glutammato 0,5 o 1 mM

18 Risultati modello in vitro

19 La rMnSOD risulta efficace nel contrastare l’incremento dei ROS. + rMnSOD 0,75 μ M Men 50 μMCtrlMen 25 μM - rMnSOD Trattamento con menadione : DCDHF-DA Risultati

20  Men 50 μ M: -30% (p< 0,01) rispetto al Ctrl.  Men 50 μ M + rMnSOD: -20% (p< 0,05) rispetto al Ctrl. Trattamento con menadione : MTT Risultati % vitalità cellulare rispetto al Ctrl ** *

21 La rMnSOD risulta efficace nel contrastare l’incremento dei ROS indotto dal glutammato. Trattamento con glutammato : DCDHF-DA Risultati + rMnSOD 0,75 μ M - rMnSOD Ctrl Glutam 0,5 mM Glutam 1 mM

22  Glut 1 mM: -16% (p< 0,05) rispetto al Ctrl.  Glut 1 mM+ rMnSOD: -15% (p< 0,01) rispetto al Ctrl.  Glut 0,5 mM+ rMnSOD: -18% (p< 0,01) rispetto al Ctrl. Trattamento con glutammato: MTT Risultati % vitalità cellulare rispetto al Ctrl * **

23 Riassumendo: rMnSOD & modello in vivo Nessun effetto sul profilo cognitivo degli animali trattati. Riduzione significativa di IL-1β, IL-2, TNF-α e sTNF- RII. Riduzione vicina alla significatività di IL-1α, IL- 3, I-TAC e LIX. Aumento significativo di MIP-1γ. Probabilmente attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo. La rMnSOD è in grado di agire sulla neuroinfiammazione, modulando l’espressione di importanti fattori che la promuovono. (Dilger et al., 2008)

24 Riassumendo: rMnSOD & modello in vitro Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE. Inefficacia nel contrastare la mortalità cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicità nel co-trattamento con il glutammato. Probabilmente riconducibile all’eccessiva produzione di H 2 O 2 non viene adeguatamente eliminata, a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello. Marcata azione di scavenger dei ROS, in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato.

25 PROSPETTIVE FUTURE: Valutare l’effetto della rMnSOD su topi più anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria. Valutare l’effetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi.

26 Dipartimento di Biologia Cellulare&Neuroscienze Laboratorio di Clinica, Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso Dipartimento di Biologia e Biotecnologie "Charles Darwin" Prof. Giancarlo Poiana Grazie per l’attenzione !!!!!! Neuroteam: Annamaria Confaloni Alessio Crestini Paola Piscopo Lorenzo Malvezzi- Campeggi Roberto Rivabene Maria Lo Giudice Giulio Di Ciaccia Vania Batalha


Scaricare ppt "FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI Corso di Laurea Magistrale in Neurobiologia EFFETTI DELLA PROTEINA RICOMBINANTE MnSOD IN MODELLI IN."

Presentazioni simili


Annunci Google