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Corso di laurea specialistica magistrale Biotecnologia aula 6a ore 14.00-16.00 corso di genomica a.a. 2009/10 lezione 15 Dicembre Programmi informatici.

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1 corso di laurea specialistica magistrale Biotecnologia aula 6a ore corso di genomica a.a. 2009/10 lezione 15 Dicembre Programmi informatici per confronti genomici. Dr.P. D’addabbo lezione venerdì 11 Dicembre 2009

2 verso l’epigenetica metodi di analisi genomica cercare sul genoma le funzioni cercare i meccanismi che attivano le funzioni cercare le strutture che attivano i meccanismi per esprimere le diverse funzioni cercare come variano le strutture che attivano i meccanismi per esprimere le diverse funzioni regolazione è una definizione troppo generica? chi è che regola i regolatori? il sistema è ciclico

3 dagli enhancers alle Regulatory Regions complessi regolativi = strutture che contengono più enhancers ma anche gli insulators e modulators (inibitori) effetto sinergico : più facile da stabilire perchè funziona su geni reporter anche su cellule in vitro abbiamo visto che le RR o enhancer complex possono distare fino a megabasi dai geni che controllano come si possono studiare? come sono regolate?

4 regolazione dei regolatori regolazione trans e regolazione cis il terzo livello è quello della regolazione epigenetica ma anche questa può essere cis regolata e trans regolata la regolazione cis funziona tramite regioni di DNA a cui si legano complessi proteici e permettono il rimodellamento della cromatina con l’avvicinamento del complesso al promotore la regolazione trans funziona tramite proteine che interagiscono ad uno dei tanti possibili livelli direttamente o indirettamente

5 il livello epigenetico il livello epigenetico è quello che precede la fase in cui si attivano le regioni regolative però essendo anch’esso un sistema a base enzimatica funziona con una regolazione analoga alle altre, ma che produce effetti sulla cromatina e sul suo funzionamento come già abbiamo detto in un sistema circolare in cui la cellula riceve stimoli dall’esterno e li trasmette all’interno e viceversa - difficile definire quale sia il livello superiore - sicuramente esiste un presente ed un poi - si tratta di vedere quele è il punto presente e da quello discendono gli altri ma solo temporalmente

6 una Regione Regolativa deve avere dei confini “boundaries” “insulators” (CTCF) e poi ha le regioni interne con gli enhancers (DNAse I) al momento attuale si conoscono gli enhancers con i siti di consensus per i fattori di trascrizione esistono altre informazioni sui siti di metilazione (epigenetici) si potrebbero individuare i siti di binding o di avvolgimento ai nucleosomi

7 dal DNAse assay per individuare una regione con possibile attività di enhancer si incomincia a fare i test di sensibilità alla DNAse I si stabilisce un pattern della regione : una mappa

8 strategia DNAse I assay

9 throughput analysis of DNAse Historically, the simplest method to robustly identify active gene regulatory elements has been enzymatic digestion of nuclear DNA by nucleases such as DNaseI. Regions of extreme chromatin accessibility to DNaseI, commonly known as DNaseI hypersensitive sites, have been repeatedly shown to be markers for all types of active cis-acting regulatory elements, including promoters, enhancers, silencers, insulators, and locus control regions. However, the original classical method, which for over 25 years relied on Southern blot, was limited to studying only small regions of the genome. Here we describe the detailed protocol for DNase- chip, a high-throughput method that allows for a targeted or genome-wide identification of cis-acting gene regulatory elements. Methods Mol Biol. 2009;556: Mapping regulatory elements by DNaseI hypersensitivity chip (DNase-Chip). Shibata Y, Crawford GE.

10 le RR inserite in un contesto il contesto in cui stanno inserite è tutto da scoprire è tanto se si sa che svolgono il ruolo di regione regolativa il meccanismo di azione si comprende tramite analisi 3D la tridimensionalità dinamica spazio/temporale metodi ChIP e fluorescenza microscopi confocali un esempio : la 3’RR delle IgH

11 la regolazione delle immunoglobuline contemporaneità della maturazione del linfocita B e delle immunoglobuline le immunoglobuline sono costituite da una catena pesante ed una leggera e la produzione deve essere coordinata la produzione è regolata nelle cellule della memoria dopo lo switch isotipico e poi riattivata quando sono stimolate all’esterno i linfociti B partecipano con i T e tutti gli altri alla risposta immunitaria umorale / cellulo mediata quindi la regolazione deve tenere conto di tutte queste interazioni

12 la struttura della RR della catena pesante studiata nel topo e ritrovata nell’uomo e in tutti i mammiferi è altamente conservata i meccanismi della sincronizzazione non sono ancora noti è supposto che la soluzione stia nella compartimentazione nucleare ritorna l’ipotesi dell’

13 Locus catena leggera Locus catena leggera  Locus catena pesante Cromosoma 22 Cromosoma 2 Cromosoma 14 LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig mappe dei loci IgH e IgL attivazione selettiva e coordinata dei fenomeni maturativi (i siti di attacco alla matrice nucleare, colocalizzazione ?) TOR VERGATA U

14 Mouse Igh cluster Chromosome 12 Human Igh cluster Chromosome 14 12F1 14q32.33 mta1 JDVJDV JDVJDV crip2crip1hole mta1crip2crip1hole  a  b   JDV   JDV    elk 2.1 hs4hs1.2hs320bp 11 3’  1 hole  elk 2.2 hs4hs1.2hs3 20bp 22 3’  2 hs 4hs 3B hs 1,2hs 3A hs 4 hs 1,2hs 3 hs 4 hs 1,2hs 3 3’  2 3’  1 BAC199M11(AF450245) 86,035,00086,040,00086,045,00086,050,00086,055,00086,065,00086,070,00086,075,00086,060,000 85,894,50085,904,50085,914,50085,924,50085,934,50085,944,50085,954,500 centromerotelomero trascrizione IgH3’RR-1 IgH3’RR-2 (cloni instabili) cluster Ig topo-uomo (duplicazione) TOR VERGATA

15 Chromosome 14 IgH3’RR-2 SF AL ( 40 kb) H 22 B HS3 B U2U2 U4U4 U5 B R3 H HS1,2 E R3r U5r U1 R1 U3U3 U6 U7U7 U 8r B U6r HS4 Ub1 U 4-5 R3 U7r Ub2 B H R4 U9U9 R5 Ub3 U 10 R5 U1 1 U 12 R6 SA2.5 A2RA2F Alu U15U16 H LTR END OF HOMOLOGY WITH ALFA1 U14U13 Ub4 H 11 B HS3 B U2 U4 U5 B R3 H*H* HS1,2 E R3rU5r U1R1 Ua1 R2 U3 U6U7U8 B U6r HS4 BH Ua2 R4 Ua3 U9 Ua4 R5 U10 U11 R5 U12 R6 U13 SA2.5 A2R Alu U15 U16 H LTR END OF HOMOLOGY WITH ALFA2 K10 retrovirus ELK2 H U 14 Ua5 A B centromero   33 11 22 44 11   22 clone CHR77 ( kb) Poly A site Poly A site IgH3’RR-1 TOR VERGATA

16 LCR locus control region (nel topo 4 enhancers) IgH3’RR-1/-2 ( nell’uomo 3 enhancers/locus) V D J human chromosome 14 q 32 HS3A HS1,2A HS4A HS3B HS1,2B HS4B 33 11 22 44 11   a2 centromero duplicazione 1 duplicazione 2 mouse Ig heavy locus * HS3A HS1,2 HS3B HS4 +5,6,7 L C R    aa bb  LCR *HS = hyper sensitivity to DNase I 3’RR-13’RR-2 TOR VERGATA transcription EE EE

17 cosa ci dicono i confronti genomici confronti nelle specie delle varie strutture conservate -analisi della conservazione e variazione interspecifica -analisi della variabilità intraspecifica (polimorfismi) -individuazione delle regioni rilevanti -metodi di analisi dei confronti genomici (lezione 15 Dic) -ipotesi sui meccanismi

18 quali studi sono stati fatti sulle 3’RR IgH gli enhancers funzionano come un complesso? il sistema è ridondante e le funzioni possono sopperire e sostituirsi alle altre per mantenere il sistema funzionante per questo ci possono essere risultati discordanti tramite la disattivazione o delezione di parti del complesso a volte dei topi transgenici per la mancanza di un enhancer non hanno dato fenotipo

19 HS fragments are able to synergize with Vk,VH,IgH germline promoters (  2b,  3, ,  ) and non Ig-prmoters (c-myc) so as to enhance the transcription activity in a tissue and stage specific manner. (Ong et al, 1998) Symergic effects TOR VERGATA synergism of HS3A-B-HS1,2-HS4

20 se nell’uomo ci sono due 3’RR ci sarà un motivo ? 3 domande + 1: è cambiato il sistema di regolazione rispetto al topo ? nell’uomo si possono studiare i polimorfismi (i topi di campagna si allevano male) - dalle diverse forme alleliche si può capire il funzionamento delle due 3’RR ? - hanno tempi di attivazione diversi? perchè due 3’RR ? sono ridondanti ? - si attivano e disattivano in fasi diverse della vita del linfocita B? TOR VERGATA U


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