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FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI FLUIDI BIOLOGICI Volume totale 7-8% del peso corporeo 5-6 L.

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1 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI FLUIDI BIOLOGICI Volume totale 7-8% del peso corporeo 5-6 L di sangue in un individuo di 70 Kg Componenti Parte corpuscolata: eritrociti, leucociti, piastrine Parte liquida: plasma Coagulazione / Sedimentazione Valore ematocrito (%) = Sangue X 100 volume corpuscoli volume totale ComponenteValori EritrocitiU *1012/L D *1012/L Reticolociti25-100*109/L Piastrine *109/L Globuli Bianchi4-10*109/L Granulociti neutrofili2-7*109/L Granulociti eosinofili *109/L Granulociti basofili1-2*106/L Linfociti1-4.5*109/L Monociti *109/L

2 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI FLUIDI BIOLOGICI Valore ematocrito (%) = Sangue X 100 volume corpuscoli volume totale 45% Normale < 45% Anemia > 45% Policitemia > 45% Leucemia

3 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI FLUIDI BIOLOGICI Plasma –90% di Acqua –10% di Sostanze solide Sostanze solide del plasma Proteine semplici Albumina (69 kDa), 45 g/L, 21.8 mmHg Globuline (  1,  2, ,  ) (140 kDa), 25 g/l, 6.0 mmHg Fibrinogeno (400 kDa), 3 g/l, 0.2 mmHg Proteine coniugate (lipoproteine e glicoproteine) Enzimi Sali inorganici Siero –Plasma senza Fibrinogeno Plasma e Siero

4 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI FLUIDI BIOLOGICI Proteine plasmatiche e Diagnosi clinica Il plasma è uno tra i fluidi biologici analizzati più frequentemente a scopi diagnostici perché riflette l’attività di altri organi e la sua composizione non è modificata sostanzialmente da una propria attività metabolica La misura delle variazioni dell’attività di enzimi plasmatici può essere utilizzata, oltre che per la diagnosi, anche a scopo prognostico

5 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI FLUIDI BIOLOGICI Proteine plasmatiche e Diagnosi clinica Proteine semplici –Cirrosi epatica: diminuita sintesi di albumina –Nefrosi: eliminazione di albumina nelle urine –Anomalie ereditarie: incapacità di sintetizzare proteine plasmatiche (fibrinogeno,  -globuline, albumina) Enzimi –Tumore prostatico: aumentata fosfatasi alcalina –Pancreatiti: aumentata amilasi –Distrofia muscolare: aumentate aldolasi e creatina chinasi –Infarto del miocardio: aumentate GOT, LDH, MDH –Danni epatici: aumentati isoenzimi del LDH

6 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI FLUIDI BIOLOGICI Volume delle 24 ore nell’adulto –1200 – 1500 mL (600 mL < normali < 2000 mL) Poliuria (> 2000 mL / 24 ore) –Diabete insipido (mancato riassorbimento tubulare dell’acqua) –Insufficienza renale cronica (persa capacità di concentrare l’urina) Oliguria (< 600 mL / 24 ore) –Disidratazione –Glomerulonefrite Urina

7 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Colore –Normale: giallo-paglierino, giallo-ambra, giallo –Anormale: giallo-verdognolo, rosso-giallastro, rosso-bruno, … Limpidezza / Torbidità pH –Normalmente acido (5.5 – 6.5) –pH < 5.0: acidosi diabetica, metabolica, respiratoria –pH > 7.0: alcalosi metabolica, respiratoria Densità o peso specifico –Normalmente d = – – 70 g / 24 ore (urea, creatinina, cloruri, fosfati, solfati) –Valori elevati: diabete mellito (aumento di glucosio), oliguria –Valori bassi: diabete insipido, nefrite cronica Urina FLUIDI BIOLOGICI

8 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI FLUIDI BIOLOGICI Liquido denso e viscoso di colore variabile dal giallo, al bruno, al verde coinvolto nel metabolismo dei lipidi (sali biliari) Volume giornaliero di 500 – 1000 mL Produzione nel fegato / Accumulo nella colecisti Prelievo mediante sondaggio duodenale (bile coledoica, colecistica, epatica) Studio della funzionalità della colecisti e delle vie biliari Cristalli di colesterolo (calcolosi biliare di colesterolo) Bile

9 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Volume –~ 25 mL alla 10 a settimana di gravidanza –800 – 1000 mL al termine Alla sua formazione contribuiscono: –Urine fetali (dalla 20 a settimana) –Secreti dell’albero tracheo-bronchiale, delle ghiandole salivari, della mucosa buccale –Secrezioni dell’apparato respiratorio (fasi avanzate) L’analisi del liquido amniotico è di grande importanza dal punto di vista clinico perché consente di studiare lo stato e lo sviluppo del feto Liquido amniotico FLUIDI BIOLOGICI

10 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Alfa-fetoproteina (AFP) –Diminuisce a partire dalla 14 a settimana fino alla fine della gravidanza –Utilizzata per determinare con una certa accuratezza l’età del feto –Valori elevati di AFP sono presenti nel caso di difetti del tubo neurale Fosfolipidi (fosfatidilcolina / sfingomielina) –Indice di maturità polmonare fetale –Valore massimo alla 38 a settimana Creatinina –Indice di maturità fetale (sviluppo delle masse muscolari e maturazione del rene) –Valore soglia di maturità fetale: 2 mg / dL Analiti nel liquido amniotico FLUIDI BIOLOGICI

11 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Liquido viscoso, opalescente prodotto dalle ghiandole salivari Volume giornaliero di 1000 – 1500 mL pH compreso tra 6 e 7 Principali componenti organici: ptialina (  -amilasi) e mucina Attraverso le ghiandole salivari vengono escrete sostanze di natura farmacologica, sostanze tossiche (es. sali di mercurio e piombo), ormoni (es. cortisolo) e virus (es. rabbia) Saliva FLUIDI BIOLOGICI

12 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Raccolte patologiche di liquido in cavità preformate rivestite di epitelio Principali cavità: pleurica, peritoneale, pericardica I trasudati si formano per ragioni idrodinamiche che provocano fuoriuscita della parte liquida del sangue (es. ascite nella cirrosi epatica) Gli essudati si formano per vasodilatazione attiva dei capillari in corso di processi infiammatori. Si ha fuoriuscita non solo di plasma, ma anche di cellule (leucociti) Analisi di versamenti cavitari –Ricerche batteriologiche –Ricerche parassitologiche (es. echinococco nella cavità pleurica) –Ricerca di cellule neoplastiche Versamenti cavitari FLUIDI BIOLOGICI

13 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI CAMPIONAMENTO, PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI BIOLOGICI Queste fasi sono molto importanti da un punto di vista analitico La attendibilità del dato analitico finale, quindi la sua qualità, dipende non solo dalla “bontà” del metodo utilizzato e dalla qualità di esecuzione del metodo stesso, ma anche dalla appropriatezza delle modalità di campionamento, prelievo e conservazione dei campioni, che devono quindi essere standardizzate Queste fasi determinano la variabilità pre-analitica di un metodo

14 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI CAMPIONAMENTO Scelta della fase del ciclo biologico più opportuna per la raccolta dei campioni La raccolta dei campioni deve essere effettuata nelle condizioni più idonee per fornire dati attendibili Le condizioni ottimali, inoltre, dovrebbero essere relativamente facili da riprodurre perché in esse vengono definiti i valori di riferimento Tali condizioni variano a seconda del tipo di indagine da effettuare In molti casi la condizione ideale è lo stato basale: paziente a riposo, a digiuno da ore, esente dall’assunzione di farmaci o sostanze che potrebbero interferire con qualche processo metabolico Nello screening delle portatrici di distrofia muscolare di Duchenne il prelievo di sangue viene effettuato nel tardo pomeriggio, dopo una giornata di lavoro, perché in queste condizioni l’attività sierica della creatinfosfochinasi (CK) risulta più elevata rispetto ai controlli sani, mentre in condizioni basali rientra solitamente nell’intervallo di riferimento

15 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Si adottano diverse modalità di campionamento a seconda dello scopo per cui il prelievo viene eseguito –Indagine diagnostica –Monitoraggio dell’azione di farmaci o di terapie fisiche –Prove funzionali da carico Indagine diagnostica –Le condizioni basali non sono sufficienti per standardizzare il prelievo –Altri fattori possono modificare significativamente qualche parametro biochimico o ematologico Esercizio muscolare (innalzamento LDH per 24 ore) Stato ansioso (aumento leucociti, alterazione equilibrio acido-base) Postura ed uso del laccio emostatico CAMPIONAMENTO

16 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Monitoraggio dell’azione di farmaci –Analisi del farmaco circolante (prelievi ad intervalli definiti in base alla farmacocinetica) –Monitoraggio degli effetti terapeutici (stato basale) –Monitoraggio degli eventuali effetti tossici (stato basale) Prove funzionali da carico –Curva da carico con glucosio per via orale per valutare il metabolismo dei glucidi (1 prelievo basale + 5 prelievi ogni 30 min) –Glicemia post-prandiale per accertare sospetto diabete (prelievo 2 ore dopo un pasto ricco di glucosio) CAMPIONAMENTO

17 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI PRELIEVO Sangue venoso, capillare, arterioso Sangue venoso –Idoneo per la maggior parte delle analisi –Prelevato dalle vene dell’avambraccio e della regione anteriore del gomito –Prelevato con siringhe sterili in provette di plastica o in vacutainer di vetro siliconato Sangue capillare –In realtà è un misto di sangue arterioso, capillare, venoso e liquido interstiziale –Prelevato dal lobo dell’orecchio o dalla falange distale mediante lancetta sterile per puntura cutanea –Usato quando occorre un piccolo volume di sangue (< 1 mL), nei neonati e bambini piccoli, ustionati, ecc. Sangue arterioso –Utilizzato per determinare la concentrazione dei gas ematici (O 2, CO 2 ) e il pH, cioè parametri misurati per valutare l’equilibrio acido-base del sangue –Prelevato da arterie del braccio o dalla femorale mediante siringhe sterili

18 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI PLASMA o SIERO ? Quando si deve analizzare la parte liquida del sangue, si potrebbero utilizzare indifferentemente plasma o siero, tranne quando si deve determinare il fibrinogeno Una tendenza è quella di utilizzare il plasma come oggetto di studio più “fisiologico” rispetto al siero Infatti, il processo della coagulazione in vitro coinvolge non solo la parte corpuscolata ed i fattori della coagulazione ma, attraverso i danni subiti dalle cellule inglobate nel coagulo, induce la liberazione di parte del contenuto cellulare, con conseguente variazione significativa di alcuni parametri biochimici nel siero rispetto al plasma D’altra parte, per ottenere il plasma (per impedire la coagulazione) è necessario aggiungere sostanze chimiche che a loro volta potrebbero alterare il campione Si potrebbe anche effettuare la defibrinazione del sangue con metodo fisico (agitazione continua del sangue a contatto con bacchette o palline di vetro fino a deplezione completa di fibrinogeno e di piastrine). Questo sistema è però dispendioso e non applicabile all’analisi di routine. È riservato alla preparazione di materiale per il controllo di qualità in ematologia e alla ricerca clinica

19 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI PLASMA Per molte indagini ematologiche e per le emocolture il sangue deve essere mantenuto fluido, evitando così la coagulazione Le indagini riguardanti la struttura e/o le funzioni delle cellule ematiche richiedono che le cellule stesse restino inalterate La scoagulazione del sangue si ottiene con l’aggiunta di sostanze chimiche (anticoagulanti) che esercitano il loro effetto con meccanismi diversi: –Chelanti del calcio –Eparina Normalmente le provette in cui si raccoglie il sangue sono già predisposte e contengono una quantità stabilita di anticoagulante in forma solida o di soluzione concentrata. È indicato il livello corrispondente alla quantità di sangue da raccogliere in modo da ottenere la concentrazione finale ottimale di anticoagulante L’uso improprio o inaccurato degli anticoagulanti può contribuire ad aumentare la variabilità pre-analitica

20 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI ANTICOAGULANTI Chelanti del calcio Legano in modo irreversibile gli ioni Ca 2+ presenti nel sangue indispensabili in varie fasi della cascata emocoagulativa –L’EDTA (acido etilendiamminotetracetico) è il più usato (sale disodico oppure bi- o tripotassico) È necessario per studi morfologici delle cellule ematiche –Il citrato di sodio viene utilizzato per la determinazione della VES e per studi di funzionalità piastrinica, in cui EDTA ed eparina non possono essere usati perché provocano aggregazione piastrinica –Un altro chelante del calcio è una miscela di ossalati di ammonio e di potassio Eparina –Agisce come cofattore dell’antitrombina III, in combinazione con la quale inattiva rapidamente la trombina e il fattore X (dieci) attivato –L’eparina è molto usata ma NON è utilizzabile per studi morfologici perché conferisce alle cellule una colorazione scura

21 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI SIERO Se l’analisi viene effettuata sul siero il campione di sangue viene lasciato 1 – 2 ore a T.A. per consentire la formazione del coagulo Viene poi centrifugato a 3000 g (forza centrifuga relativa) per 10 min per consentire il recupero del maggiore volume possibile di siero Spesso, per facilitare la separazione tra coagulo e siero, le provette in cui il sangue viene raccolto contengono sostanze con peso specifico intermedio tra quelli delle cellule ematiche e del siero, ad esempio perline di polistirene che durante la centrifugazione si dispongono tra coagulo e siero Il siero deve essere separato dal coagulo il più presto possibile per evitare il rilascio di sostanze dalle cellule, che potrebbero alterarne la composizione

22 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI ANTICOAGULANTI Tappo grigio: ossalato, fluoruro e idoacetato Tappo giallo: tubo sterile senza anticoagulanti Tappo verde: eparina Tappo rosso: per siero Tappo rosso-nero: per siero con gel-separatore Tappo blu: citrato Tappo lavanda: EDTA

23 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Red top Contains: Effect on specimen: Uses: None Blood clots and serum separated by centrifugation Chemistries, Immunology, serology,Blood Bank Red-Grey Mottled top Contains: Effect on specimen: Uses: Serum separating tube with clot activator Form clot quickly, separate the serum at the bottom Blood type screening and chemistries Gold top Contains: Effect on specimen: Uses: Separating gel and clot activator gel at the bottom to separate blood from serum on centrif. Serology, endocrine, immunology, HIV Light green top Contains: Effect on specimen: Uses: Plasma saeparating tube Na-Heparin Plasma separated at the bottom of the tube Chemistries Vacutainer tube®

24 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Lavender/Purple top Contains: Effect on specimen: Uses: EDTA (liquid form) Forms calcium salt to remove calcium Hematology and Blood Bank Light blue top Contains: Effect on specimen: Uses: Sodium citrate Forms calcium salt to remove calcium Coagulation tests, tube filled 100% Dark green top Contains: Effect on specimen: Uses: Sodium heparin or litium heparin inactivates thrombin ammonia,lactate,lithium level, Dark blue top Contains: Effect on specimen: Uses: Sodium heparin or Na2EDTA Forms calcium salts Toxicology and drugs test Vacutainer tube®

25 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Light gray top Contains: Effect on specimen: Uses: Sodium fluoride potaxium oxalate Antyglycolitic agent to preserve glucose Lithium level, glucose Yellow top Contains: Effect on specimen: Uses: ACD (acid-citrate-dextrose) Complement inactivation Paternity tests, DNA studies Tan/brown top Contains: Effect on specimen: Uses: Sodium heparin inactivates thrombin serum lead determination Black top Contains: Effect on specimen: Uses: Sodium citrate (buffered) Forms calcium salts Westergren sedimentation rate Vacutainer tube®

26 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Orange top Contains: Effect on specimen: Uses: Thrombin Quickly clots blood STAT chemistries blood Vacutainer tube®

27 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI EMOLISI Rottura dei globuli rossi con conseguente liberazione di emoglobina nel siero o nel plasma Visibile macroscopicamente perché il colore passa dal giallo al rosato- rosso L’emolisi è una delle ragioni più frequenti di inadeguatezza qualitativa dei campioni di sangue –Errori di tipo analitico-metodologico –Errori dovuti a cause fisiologiche

28 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Interferenze fisiche Assorbimento dell’emoglobina attorno a 405 nm e a nm che interferisce su analisi colorimetriche Errori controllabili mediante strumenti che effettuano letture a due lunghezze d’onda Interferenze chimiche Inibizione di reazioni di diazotazione o di reazioni enzimatiche utilizzate per la determinazione di certi analiti Interferenze di tipo analitico-metodologico EMOLISI

29 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Sono dovute ad ineguale distribuzione di molte sostanze tra la parte liquida e la parte corpuscolata del sangue –Ad esempio, glucosio, colesterolo totale, esteri del colesterolo, Na +, Cl - hanno concentrazione più elevata nel plasma che nei globuli rossi, perciò nei casi di emolisi massiva si ha una diluizione di questi componenti –Al contrario (più frequentemente e con maggiore rilevanza) enzimi quali fosfatasi acida, transaminasi, lattato deidrogenasi e ioni quali K + hanno concentrazione più elevata all’interno degli eritrociti piuttosto che nel plasma, perciò in caso di emolisi si ha una sovrastima Interferenze di tipo fisiologico EMOLISI

30 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Livelli di concentrazione di alcuni analiti nei globuli rossi e nel plasma Analiti Globuli rossi Plasma Glucosio mg/dl Azoto non proteico mg/dl Acido urico mg/dl Colesterolo totale mg/dl Colesterolo esteri mg/dl Na + mmol/l K + mmol/l Cl - mmol/l HCO 3 - LDH mU/ml GOT(AST) mU/ml 74,0 40,0 2, , ,0 8,0 4, , EMOLISI

31 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI CAUSE DI EMOLISI Biologiche –Anemie emolitiche per difetti endogeni o esogeni Endogeni: difetti morfologici o deficienze di enzimi endoeritrocitari Esogeni: anticorpi (emolisine) acquisiti in seguito a reazioni trasfusionali, anemie emolitiche autoimmuni, infezioni, assunzione di farmaci Meccaniche –Uso di aghi troppo sottili e/o aspirazione eccessiva durante il prelievo –Centrifugazione a velocità troppo elevata Chimiche o osmotiche –Presenza di disinfettanti, detergenti, acqua o altre sostanze chimiche sulla cute, nell’ago o nella provetta Fisiche –Conservazione prolungata del campione in condizioni non idonee, soprattutto di temeperatura (troppo elevata o troppo bassa) Ad esempio, il congelamento provoca cristallizzazione dell’acqua endoeritrocitaria e rottura delle membrabe

32 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Invio Spedizione intra o extramurale Ambulatori utenza esterna Reparti clinici Ricezione controllo selezione Chimica Centrifugazione Ematologia microbiologia emocoagulazione ecc... Separazione siero-plasma Accettazione Conservazione +4°C; -20°C Consegna agli analisti Eventuale deproteinizzazione Eventuale conservazione TRATTAMENTO PRE-ANALITICO

33 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Idealmente il campione biologico dovrebbe essere analizzato immediatamente Nella realtà questo accade solo per le urgenze, mentre in tutti gli altri casi i campioni vengono conservati per un certo tempo prima dell’analisi per ragioni economiche ed organizzative Inoltre, può essere necessario conservare i campioni per ripetere l’analisi o effettuare analisi diverse successivamente Un altro fattore critico da tenere in considerazione, per il suo possibile effetto sulla variabilità pre-analitica, è il trasporto dei campioni dal luogo di prelievo al laboratorio di analisi

34 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI CAUSE DI ALTERAZIONE DEI CAMPIONI I campioni biologici possono alterarsi per cause diverse ed in tempi diversi Schematicamente: Cause di natura fisica Tempi relativamente lunghi Cause di natura chimico-fisica Tempi brevi o medi Cause di natura biochimica Tempi brevissimi o brevi e/o biometabolica In realtà si può avere sovrapposizione di cause

35 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI CAUSE DI ALTERAZIONE DEI CAMPIONI Riguardano prevalentemente cambiamenti di fase (liquido-solido, liquido-vapore) Evaporazione Provoca aumento della concentrazione degli analiti, quindi inficia l’accuratezza della misura Dipende da temperatura, umidità relativa, ventilazione, geometria e volume di riempimento del contenitore Solubilità Sangue, siero e plasma hanno una componente proteica che funge da stabilizzatore Nell’urina abbassamenti di temperatura a valori ambiente o di frigorifero (+4°C) e variazioni di pH possono ridurre la solubilità (precipitazione) Adsorbimento Elementi oligominerali (metalli) possono essere adsorbiti sulla parete dei contenitori. Sono necessari materiali inerti Desorbimento Cessione di materiale dai contenitori, in particolare metalli. Il vetro presenta questo problema, polipropilene e teflon sono più appropriati Cause di natura fisica

36 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI CAUSE DI ALTERAZIONE DEI CAMPIONI Fotolisi Dovuta all’interazione della luce solare con molecole fotoassorbenti che vengono alterate (ad es. bilirubina, composti porfirinici, vitamine) Denaturazione Modificazione sterica o strutturale di siti attivi di proteine enzimatiche o recettoriali tissutali Può dipendere da tempo, temperatura, pH, composizione della matrice biologica Aggregazione A carico di proteine tra cui si formano legami a basso contenuto energetico: ponti disolfuro, legami idrogeno, forze di van der Waals ed elettrostatiche Alterazione delle caratteristiche di legame delle proteine stesse Cause di natura chimico-fisica Includono processi chimico-fisici in grado di indurre modificazioni nella composizione o nella struttura di alcuni costituenti biochimici

37 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI CAUSE DI ALTERAZIONE DEI CAMPIONI In vivo è attivo un sistema di regolazione omeostatica che mantiene costante la concentrazione dei metaboliti In vitro questo sistema manca Inoltre, cambiano la temperatura e la natura delle pareti del “contenitore” e si ha contatto con l’aria Anche in poche ore si possono avere drastici aumenti o decrementi di concentrazione di alcuni analiti Cause di natura biochimica e/o biometabolica

38 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Variazione concentrazione acido lattico in vitro a T amb eparina EDTA KF Variazione concentrazione ammonica plasmatica in vitro a T amb con anticoagulanti CAUSE DI ALTERAZIONE DEI CAMPIONI Cause di natura biochimica e/o biometabolica

39 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI CAUSE DI ALTERAZIONE DEI CAMPIONI Conservazione alla temperatura ottimale Conservazione al buio Liofilizzazione Modificazione del pH Aggiunta di sostanze chimiche per evitare fenomeni indesiderati (ad es. sostanze che impediscono l’ossidazione dei gruppi –SH e la formazione di ponti disolfuro, quali il ditiotreitolo, DTT) Provvedimenti

40 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI VARIABILITÀ GLOBALE La variabilità globale di un test di laboratorio è espressa in termini statistici dalla varianza totale S 2 totale = S 2 pre-analitica + S 2 analitica + S 2 post-analitica

41 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI VARIABILITÀ PRE-ANALITICA Composizione del materiale biologico del soggetto –Campionamento –Variabilità biologica (età, sesso, razza) Composizione del materiale biologico come conseguenza delle modalità di effettuazione del prelievo (ad es. emolisi) Composizione, proprietà o morfologia del materiale biologico come conseguenza del trattamento immediato (ad es. anticoagulanti) Composizione, proprietà o morfologia del materiale biologico come conseguenza della conservazione La variabilità pre-analitica dipende da condizioni che possono influenzare:

42 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI VALORI DI RIFERIMENTO Per alcune patologie, la sola presenza dell’analita in oggetto costituisce la conferma che la patologia in esame è in atto. In genere però una patologia si traduce in una semplice variazione del parametro in esame, quindi il risultato analitico deve essere confrontato con i valori “normali” per la popolazione, di solito indicati come “valori di riferimento”. Per essere utile dal punto di vista diagnostico, un valore di riferimento deve spesso essere valutato all’interno di un solo settore della popolazione, che sia più “omogeneo” (es. con simili caratteristiche genetiche ed ambientali) e confrontabile con il paziente in esame. In questo modo il valore di riferimento acquista un rilevante “valore predittivo”.

43 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI Quali parametri influenzano i valori di riferimento? - Fattori genetici. Molte anomalie nel metabolismo sono legate a fattori genetici. Criteri distintivi importanti sono i gruppi sanguigni e gli antigeni di istocompatibilità. - Fattori fisiologici. Molte condizioni fisiologiche determinano variazioni consistenti in alcuni parametri biochimici. Età (livelli ormonali, azotemia, colesterolo…) Sesso (sideremia, acido urico, livello ormonale,gonadotropine, azotemia…) Eccesso di peso (colesterolo, trigliceridi…) Ora e giorno del prelievo (variazioni periodiche del colesterolo, catecolamine, sideremia…) Modalità del prelievo (bicarbonati, proteine…) Postura (attraverso la diversa distribuzione dell’acqua nell’organismo influenza calcio, proteine, colesterolo…) Spesso problematico è il caso dei bambini, specialmente durante i primi giorni o le prime settimane di vita, in quanto esistono parametri fisiologici il cui range “normale” varia molto rapidamente col passare del tempo. - Fattori esogeni. Includono l’alimentazione (colesterolo, trigliceridi), l’attività fisica o professionale, il fumo, l’alcool, l’assunzione di farmaci… VALORI DI RIFERIMENTO

44 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI VALORI DI RIFERIMENTO Convenzionalmente, si definiscono “normali” i valori che comprendono il 95% dei risultati ottenuti in una popolazione apparentemente sana, supponendo con ciò che ogni specie tenda a contenere le variazioni delle grandezze biologiche entro certi limiti. L’intervallo corrispondente è l’intervallo di riferimento. Il modo con cui si ricavano i valori “normali” dipende anche dal tipo di distribuzione statistica del parametro misurato nella popolazione: - Distribuzione gaussiana - Distribuzione log-gaussiana - Distribuzione non classificabile o irregolare (es. distribuzione bimodale…)

45 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI VALORI DI RIFERIMENTO Distribuzione gaussiana. Se il parametro in esame presenta una distribuzione gaussiana all’interno della popolazione, l’intervallo di riferimento è quello compreso entro due deviazioni standard dalla media della popolazione. - 2  + 2  95% 2,5% Le percentuali in oggetto sono comunque arbitrarie. E’ stato infatti proposto anche un criterio in base al quale i valori nei quali rientra l’80% della popolazione sarebbero “normali”, i valori dall’80% al 98% dubbi ed i valori nei quali rientra il 2% della popolazione sarebbero patologici.

46 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI VALORI DI RIFERIMENTO Distribuzione log-gaussiana. Spesso la distribuzione si presenta asimmetrica rispetto ad una distribuzione gaussiana con una maggiore percentuale di valori elevati. E’ abbastanza comune che in questo caso la distribuzione sia assimilabile ad una gaussiana se il diagramma viene costruito utilizzando il logaritmo del parametro in esame (es. una concentrazione) piuttosto che il parametro stesso. XLog X

47 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI VALORI DI RIFERIMENTO Per distribuzioni non gaussiane e non riconducibili in alcun modo ad una gaussiana (ad esempio le distribuzioni bimodali) si utilizza il metodo dei percentili. La popolazione viene divisa in un certo numero di categorie in base al valore del parametro e se ne traccia il profilo sotto forma di istogramma. Su questo grafico si determinano i valori del parametro al di sopra (o sotto) i quali cade una percentuale prefissata della popolazione. Intervalli del parametro Frequenza nella popolazione 2,5% 95% 2,5%

48 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI

49 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO DI UN TEST

50 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI VALORI DI RIFERIMENTO La valutazione della capacità di un test di laboratorio di diagnosticare una determinata patologia (significato diagnostico) parte dall’esame delle differenze nel parametro in esame fra la popolazione sana e qualle malata, quindi dal confronto delle distribuzioni statistiche della grandezza nelle due popolazioni. Siccome il risultato del test è affetto da varianze dovute alla reale distribuzione della grandezza in esame che agli errori associati all’analisi, in generale esiste un certo grado di sovrapposizione fra i valori delle due popolazioni. La linea di demarcazione (valore discriminante) che classifica il test come positivo deve quindi venire scelta in modo oculato, in funzione di - forma della distribuzione nella popolazione normale e malata - dimensione e proporzioni delle popolazioni considerate - costo derivante da una decisione sbagliata

51 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO DI UN TEST Si definisce sensibilità clinica (positività) del test diagnostico la capacità del test di classificare come positivi gli individui veramente affetti dalla malattia. Essa viene comunemente espressa come: Sensibilità clinica = 100 VP/(VP + FN) dove VP (veri positivi) sono i risultati correttamente classificati dal test come positivi e FN (falsi negativi) sono i risultati di soggetti malati classificati erroneamente cone negativi (VP + FN sono ovviamente tutti i soggetti malati all’interno del campione esaminato). La specificità clinica (negatività) del test diagnostico è invece la capacità del test di classificare come negativi gli individui sani. Per analogia essa è data da: Specificità clinica = 100 VN/(VN + FP) dove VN (veri negativi) sono i risultati correttamente classificati dal test come negativi e FP (falsi positivi) sono i risultati di soggetti sani classificati erroneamente cone positivi (VN + FP sono ora i soggetti sani all’interno del campione esaminato).

52 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO DI UN TEST La somma delle due grandezze viene talvolta definita potenza diagnostica (assoluta) del test. sani malati TEST IDEALE Sensibilità clinica 100% Specificità clinica 100% Potenza diagnostica 200% sani malati TEST INUTILE Sensibilità clinica 50% Specificità clinica 50% Potenza diagnostica 100% sani malati TEST REALE Sensibilità clinica % Specificità clinica % Potenza diagnostica %

53 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO DI UN TEST Nel caso reale la classificazione dei risultati come positivi o negativi passa attraverso la definizione di un punto di separazione (livello di normalità o “cut off”) che viene operativamente utilizzato per classificare i risultati come negativi o positivi. La scelta del valore specifico di “cut off”, che influenza sia la specificità che la sensibilità, dipende però dal particolare problema clinico considerato, dalla proporzione delle due popolazioni e dal costo relativo delle false attribuzioni positive o negative. sani malati “cut off” sani malati Sensibilità clinica = 100% specificità clinica bassa Sensibilità clinica bassa specificità clinica = 100%

54 FACOLTA’ DI SCIENCE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA E CLINICA TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO DI UN TEST Il livello di normalità o “cut off” viene quindi scelto all’interno della zona di sovrapposizione fra le due popolazioni. Un altro parametro spesso utilizzato per definire le capacità di un test diagnostico è il valore predittivo o discriminante, dato dalla: sani malati Valore predittivo = 100 VP/(VP + FP) che indica quindi la percentuale dei casi positivi che risulta effettivamente affetta dalla malattia. In pratica questo parametro dipende non solo dalla sensibilità e dalla specificità, ma manche dalla prevalenza (percentuale della popolazione affetta dalla malattia). Sensibilità 95% e specificità 95% danno un valore predittivo del 95% se la prevalenza è del 50%. Il valore predittivo scende però al 16% ed al 2% se la prevalenza è dell’1% e dello 0,1%.

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