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Clonaggio PCR Amplificazione DNA. Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006.

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Presentazione sul tema: "Clonaggio PCR Amplificazione DNA. Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006."— Transcript della presentazione:

1 Clonaggio PCR Amplificazione DNA

2 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

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4 sito di restrizione

5 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

6 Gli enzimi di restrizione possono generare diversi tipi di estremità

7 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

8 Uso degli enzimi di restrizione Clonaggio Mappa di restrizione Polimorfismi di restrizione (RFLP)

9 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

10 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Scelta e preparazione del vettore Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

11 Vettori di clonaggio Plasmidi Virus Trasposoni Minicromosomi artificiali

12 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

13 Vettori plasmidici

14 1.Origine di replicazione 2.Marcatore di selezione 3.Sito di restrizione unico Elementi di un vettore plasmidico

15 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

16 Preparazione del DNA da clonare Frammento di DNA genomico che può contenere regioni trascritte o non trascritte cDNA: DNA ottenuto per trascrizione inversa dell’mRNA, che quindi contiene tutto o parte di una regione trascritta frammentato con enzimi di restriz. frammentazione meccanica DNA specifico Collezione DNA (banca, genoteca) Digestione clone già esistente PCR

17 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

18 PREPARAZIONE del cDNA RNA DNA

19 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

20 Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolare mediante ligasi di estremità coesive GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC G EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G CTTAA EcoRI VETTORE INSERTO

21 Unione, mediante ligasi, di estremità coesive create da un enzima di restrizione GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC G EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG DNA ligasi GAATTC CTTAAG VETTORE G CTTAA AATTC G INSERTO

22 strategie controlli Reazione di ligasi

23 trattamento del vettore con fosfatasi G CTTAAp pAATTC G G AATTC CTTAApG GpAATTC CTTAA G DNA ligasi pAATTC G CTTAAp EcoRI G CTTAA AATTC G fosfatasi GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Clonaggio con singola digestione

24 Clonaggio con doppia digestione GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA G CTTAA AGCTT A EcoRI AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII AAGCTT TTCGAA HindIII

25 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

26 Introduzione del DNA nella cellula ospite Trasformazione: CaCl2 Impacchettamento e infezione fagica In E.coli Elettroporazione In cellule di eucarioti superiori Trasfezione (transiente o stabile): Calcio fosfato Liposomi Elettroporazione Microiniezione DNA gun

27 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

28 Vettori plasmidici

29 Strategie di selezione nel clonaggio AMPICILLINA resistenza

30 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

31 1200 bp SacI EcoRI

32 1.lisi cellulare 2.deproteinizzazione 3.concentrazione Isolamento acidi nucleici

33 Deproteinizzazione: agenti enzimatici solventi organici Precipitazione: cationi + etanolo (Na, NH4) isopropanolo Purificazione acidi nucleici

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36 Protocollo “artigianale” Colonnine cromatografiche (kit commerciali) Isolamento DNA plasmidico

37 Protocollo artigianale Lisi cellulare con NaOH/SDS Neutralizzazione con Kacetato (precipitazione di proteine) Estrazione fenolo/cloroformio Precipitazione con isopropanolo Risospensione delle cellule in tampone con RNasi Risospensione in TE

38 Spettrofotometro (quantitativa) Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa) Analisi acidi nucleici

39 Spettro di assorbimento del DNA lunghezza d’onda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD 260 =50  g/ml OD 260 /OD 280 =1,8-2,0

40 Elettroforesi di acidi nucleici Gel di agarosio Gel di acrilammide

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43 Elettroforesi su gel di agarosio

44 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

45 Migrazione del DNA su gel Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.

46 Fattori che influenzano la migrazione Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi

47 Visualizzazione del DNA

48 Marcatori di peso molecolare HindIII

49 ESERCITAZIONI DI BIOLOGIA MOLECOLARE AA 2006/2007 Descrizione generale esercitazioni di laboratorio Analisi del risultato di un clonaggio mediante elettroforesi su gel di agarosio: 1) Preparazione di DNA plasmidico dalle colonie trasformate 2) Analisi del DNA plasmidico su gel di agarosio Preparazione soluzione per la digestione con enzimi di restrizione 3) Digestione DNA plasmidico con enzimi di restrizione Analisi spettrofotometrica del DNA preparato 4) Analisi della digestione su gel di agarosio Discussione dei risultati

50 1200 bp SacI EcoRI

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52 Metodi di lisi cellulare TecnicaApplicazione Metodi non meccanici Shock osmotico Tessuti animali molli, alcune cellule vegetali Congelamento/scongelamentoTessuti animali molli, alcuni batteri Enzimi liticiCellule animali e vegetali Detergenti (NP40, SDS) Cellule in coltura, batteri Metodi meccanici Pestello e mortaioTessuti resistenti Sfere di vetroBatteri e funghi Omogenizzatore a motoreTessuti vegetali e animali Omogenizzatore a manoTessuti molli delicati Estrusione solida (Hughes press)Materiale vegetale resistente Estrusione liquida (French press)Microorganismi UltrasonicazioneMicroorganismi

53 Vettori procariotici Plasmidi Fagi Cosmidi naturali artificiali Col E1 pSC101 pBR322 pUC8 pEMBL8 lambda M13


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