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1966 Universita’ di Bari 1-3 gruppo A4-5 gruppo B X-6-12 gruppo C 13-15 gruppo D 16-18 gruppo E 19-20 gruppo FY-21-22 gruppo G by GP&NA Conferenza di Denver.

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1 1966 Universita’ di Bari 1-3 gruppo A4-5 gruppo B X-6-12 gruppo C gruppo D gruppo E gruppo FY gruppo G by GP&NA Conferenza di Denver

2 Universita’ di Bari by GP&NA 1-3 gruppo A4-5 gruppo B X-6-12 gruppo C gruppo D gruppo E gruppo F Y gruppo G Cariotipi a confronto

3 *Creano un’alternanza di bande chiare e scure lungo l’asse del cromosoma specifica per ogni coppia di omologhi. *Colorano una regione specifica di alcuni o di tutti i cromosomi C-bande : tutti i centromeri e le regioni eterocromatiche variabili dei cromosomi 1,9,16,Y Universita’ di Bari by GP&NA Metodi colorazione differenziale

4 utilizzando la mostarda di quinacrina Universita’ di Bari by GP&NA QM-banding pattern

5 Universita’ di Bari by GP&NA DAPI e QM

6 Universita’ di Bari by GP&NA G-bande

7 Universita’ di Bari by GP&NA R-bande

8 Universita’ di Bari by GP&NA Diagramma

9 46,XX - cariotipo normale Femminile 46,XY - cariotipo normale Maschile Questo modo di scrivere ci da’ due informazioni: - numero totale dei cromosomi (46) - sesso dell’organismo 47,XY,+21 Maschio con 47 cromosomi (invece di 46) ed un cromosoma 21 in piu’ (sindrome di Down) 46,XX,del(14)(q23)del=delezione 46,XY,dup(14)(q22q25)dup= duplicazione 46,XX,r(7)(p22q36)r=ring (cromosoma ad anello) Terminologia Universita’ di Bari by GP&NA

10 Universita’ di Bari by GP&NA doppia elica di DNA ATCGGTATCCTA T A GGCATAGGAT osservazione del vetrino ATCGGTATCCTA T A GGCATAGGAT denaturazione cromosoma sul vetrino sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo ibridazione della sonda sui cromosomi denaturati sul vetrino A T C G G T A T C C T A ATCGGTATCCTA T A GGCATAGGAT T T A GGCATAGGA FISH ATCGGTATCCTA T A GGCATAGGAT ATCGGTATCCTA T A GGCATAGGAT denaturazione

11 Universita’ di Bari by GP&NA  filtro di emissione specchio dicroico filtro di eccitazione obiettivo/ condensatore    fotografia CCD camera Lampada a vapori di mercurio Elaborazione al computer FISH : microscopio a fluorescenza  Osservazione al microscopio

12 Cromosomi 1. denaturati 2. colorati con DAPI Universita’ di Bari by GP&NA FISH: metafase in DAPI

13 Universita’ di Bari by GP&NA FISH: segnali

14 Universita’ di Bari by GP&NA FISH: merge

15 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini Universita’ di Bari by GP&NA Analisi del cariotipo

16 sangue periferico terreno di coltura 48-96h proliferazione colchicina (ultimi 30’) centrifugazione pellet risospeso Ipotonica (20’) centrifugazione pellet risospeso fissativo centrifugazioni (2-3) fissativo risospensione in poco fissativo allestimento del preparato Universita’ di Bari by GP&NA Allestimento del preparato fitoemoagglutinina (stimola la crescita)

17 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini Universita’ di Bari by GP&NA Analisi del cariotipo

18 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine *Fluorocromi: QM, DAPI. Necessario un microscopio a flurescenza Universita’ di Bari by GP&NA Colorazione QM

19 G-banding con Giemsa dopo trattamento con tripsina 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine Universita’ di Bari by GP&NA Colorazione Giemsa

20 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini Universita’ di Bari by GP&NA Analisi del cariotipo

21 Universita’ di Bari by GP&NA Selezione delle metafasi Ottima ma…..

22 Universita’ di Bari by GP&NA Selezione delle metafasi  Puo’ essere anche cosi’..  Cromosomi non ben riconoscibili, difficili anche da contare. Scartare! (potendo)

23 Universita’ di Bari by GP&NA .. O cosi’ Selezione delle metafasi  Troppo contratti pero’ si puo’ usare per contarli. Scartare! (potendo)

24 Universita’ di Bari by GP&NA Selezione delle metafasi  Sufficiente  Si possono contare Puo’ essere utile per analizzare i cromosomi non sovrapposti

25  Discreta Universita’ di Bari by GP&NA  Si possono contare, e anche se ci sono alcune sovrapposizioni, si possono analizzare Selezione delle metafasi

26 Universita’ di Bari by GP&NA Selezione delle metafasi  Buona  Si possono contare, e anche se ci sono alcune sovrapposizioni, la morfologia dei cromosomi e’ buona

27 1. SI CONTANO I CROMOSOMI : IMPORTANTE PER SOSPETTARE LA PRESENZA DI ALTERAZIONI NEL NUMERO CROMOSOMICO 2. SI APPAIANO GLI OMOLOGHI PER SIMILARITA’ 3. SI METTONO IN ORDINE SECONDO LA CONVENZIONE Universita’ di Bari by GP&NA Come si fa il cariotipo?

28 Universita’ di Bari by GP&NA Fare il cariotipo

29 CARIOTIPO IN QM (specifico il bandeggio) Universita’ di Bari by GP&NA Cariotipo ordinato


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