In gascromatografia (Gas Chromatography, GC) la fase mobile è un gas permanente (carrier o gas di trasporto) che fluisce attraverso una colonna in cui.

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1 In gascromatografia (Gas Chromatography, GC) la fase mobile è un gas permanente (carrier o gas di trasporto) che fluisce attraverso una colonna in cui è posta la fase stazionaria. All’uscita della colonna è posto il rivelatore che fornisce il gascromatogramma In cromatografia liquida (Liquid Chromatograpfy, LC) la fase mobile e` un liquido che viene fatto fluire in maniera forzata (pompe) attraverso una colonna impaccata (riempita) di fase stazionaria. FASE MOBILE FASE STAZIONARIA INTERAZIONI SOLUTO-FASE MOBILE INTERAZIONI SOLUTO-FASE STAZIONARIA INTERAZIONI FASE MOBILE-FASE STAZIONARIA

2 rapporto delle fasi: V s /V m DESCRIZIONE GENERALE DELLA RITENZIONE IN CROMATOGRAFIA FS FM

3 Classificazione delle tecniche gascromatografiche GC Gas solidoGas liquido GC Colonne impaccate I criterio (stato fisico fase stazionaria) II criterio (caratteristiche geometriche colonna ) Colonne capillari

4 Colonne impaccate: la fase stazionaria è formata da un solido granulare poroso o da un liquido deposto su un supporto costituito da particelle inerti. La colonna è costituita da un tubo di acciaio o vetro di lunghezza da 1 a 6 metri con diametro interno di 0.75-4 mm. ID 0.75-4 mm riempimento

5 Colonne capillari: la fase stazionaria viene depositata sotto forma di film sottilissimo (0.1 - 5µm) sulla parete interna di un capillare con diametro 0.1-0.75 mm e lungo da 15 a 100 m. Il carrier percorre il canale lasciato libero dalla fase stazionaria

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8 Le prestazioni di una separazione CROMATOGRAFICA vengono valutate in base a: selettività: in GC dipende solo dalla fase stazionaria e dalla sua temperatura. Non esistono differenze tra colonne impaccate e capillari efficienza: Notevoli differenze tra colonne impaccate e capillari in GC: per colonne impaccate N molto minore rispetto a colonne capillari: la permeabilità è nettamente superiore nelle colonne capillari e questo permette di raggiungere lunghezze fino a 150 m. Per aumentare l’efficienza si può agire sulle seguenti variabili: 1. Lunghezza colonna 2. Diametro delle particelle (per colonne impaccate) 3. Liquido di ripartizione: altamente selettivo per l’analita e poco viscoso 4. diametro interno della colonna (sia per colonne impaccate sia per quelle capillari) Risoluzione: dato N, è solitamente maggiore per le colonne capillari rispetto a quelle impaccate Asimmetria picchi

9 Fase Mobile: Il gas Carrier Il gas carrier deve avere le seguenti caratteristiche: elevata inerzia chimica verso gli analiti e la fase stazionaria (gas nobili e azoto) elevato grado di purezza. In particolare devono essere assenti umidità (disattivazione fase stazionaria), ossigeno (ossidazione fase stazionaria) e idrocarburi (aumento linea base) Compatibilità con il rivelatore I gas di trasporto più usati sono: idrogeno elio e miscele elio/idrogeno azoto argon Diossido di carbonio

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11 Fasi stazionarie per GC Fasi stazionarie solide (di uso limitato rispetto alle fasi liquide): Il meccanismo di separazione è per adsorbimento (la separazione dipende dalla forza di legame tra le molecole di analita e i siti attivi della fase stazionaria). Si utilizza tale tecnica per separare gas che non ripartiscono nella fase liquida (azoto, ossigeno, monossido di carbonio) e molecole organiche e in genere composti bassobollenti (metanolo, etanolo, acqua). I materiali più usati come fase stazionaria sono: Gel di silice Allumina Carbone attivo (mediamente polare) Zeoliti (silicati di alluminio e sodio)

12 Fasi stazionarie liquide: In tale tecnica le molecole di analita si sciolgono nella fase stazionaria liquida. Si ha quindi una ripartizione dell’analita tra la fase fissa (liquido) e la fase gassosa. Nelle colonne impaccate e nelle SCOT, la fase liquida è ancorata su un supporto inerte che deve avere le seguenti caratteristiche: Inerzia chimica Resistenza meccanica e termica Buon grado di bagnabilità da parte del liquido di ripartizione Bassa resistenza al flusso di gas Disponibilità sotto forma di particelle sferiche I materiali più usati sono Terra di diatomee (scheletri di piante unicellulari): materiale molto poroso con un buon grado di assorbività (fino al 30% del suo peso). I numerosi gruppi idrossilici vengono rimossi per silanizzazione con dimetilclorosilano (DMCS) o esametildisilazano (HMDS) Teflon: poco adsorbenti Vetro: poco adsorbenti

13 Silanizzazione con dimetilclorosilano (DMCS) o esametildisilazano (HMDS)

14 Nelle colonne WCOT, la fase stazionaria viene depositata sulle superficie interna della colonna di vetro o di silice fusa Liquidi di ripartizione: Il liquido di ripartizione da depositare sul supporto solido deve soddisfare numerosi requisiti tra cui: Bassa tensione di vapore (per minimizzare la perdita di liquido durante le analisi) (la tensione di vapore aumenta esponenzialmente all’aumentare della temperatura) elevata stabilità termica Elevata inerzia chimica Buon effetto solvente sulla miscela Bassa viscosità per diminuire la resistenza al trasferimento di massa Sulla base della polarità i liquidi di ripartizione si possono suddividere nelle seguenti classi: prima classe: apolari (idrocaarburi o siliconi con sostituenti non polari) seconda classe a bassa polarità quali derivati siliconici (polisilossani) con sostituenti polari terza classe: polari (poliglicoli, polialcol e loro esteri) Quarta classe: molto polari (glicoli, glicerina, idrossiacidi)

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16 Polarità soluti Regola per la scelta della fase stazionaria: la scelta si basa sulla regola “il simile sciogli il simile”. es. le colonne apolari sono le migliori per i soluti apolari ecc.

17 Componenti olio di menta Colonna apolare (escono in base al loro punto di ebollizzione) Colonna polare (Carbovax) (trattiene fortemente i soluti polari)

18 Fasi stazionarie legate: La fase stazionaria liquida, trascinata dal gas di trasporto, si impoverisce inevitabilmente con il passare del tempo (bleeding). Questo fenomeno comporta l’aumento del disturbo del segnale di fondo (ad elevate temperature) (deriva) Per ovviare tale problema si lega chimicamente la fase ai gruppi idrossilici della silice di supporto o alle pareti della colonna  fase stazionaria legata. Queste trattamento permette inoltre il lavaggio con solvente delle colonne contaminate

19 Sistema di iniezione del campione Il campione viene iniettato (mediante opportuna siringa) attraverso un setto di gomma o silicone nella camera riscaldata in testa alla colonna La camera viene generalmente riscaldata circa 50°C oltre il p.e. del componente meno volatile. Per le colonne impaccate il volume del campione varia da 0.1 a 20 µl. Per le colonne capillari la portata è notevolmente inferiore (almeno un fattore di 100) e richiedono un sistema di ripartizione

20 Iniezione frazionata (split) Le colonne capillari hanno una bassa portata: è quindi necessario che solo una frazione del campione iniettato raggiunga la colonna. Il sistema di ripartizione (split) invia solo una parte del campione alla colonna e la rimanente parte viene scaricata (rapporto di frazionamento da 1:50 a 1:100). Si usa tale tecnica quando gli analiti costituiscono almeno lo 0.1% del campione

21 Iniezione non frazionata (splitless) del campione Per campioni diluiti (gli analiti costituiscono meno dello 0.01% del campione) si utilizza la iniezione non frazionata (splitless)

22 Sistema di termostatazione della colonna La temperatura è cruciale nelle separazioni cromatografiche e pertanto la colonna è alloggiata in forni termostatati. L’analisi GC può essere effettuata a T costante (isoterma) o variabile (gradiente di temperatura). Le rampe di temperatura possono essere lineari o asimmetriche con diverse fasi di plateau. Tempo Temperatura

23 Isoterma (45°C) Isoterma (145°C) Gradiente (da 30 a 180°C)

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26 Rivelatori I rivelatori sono dispositivi posti in uscita alla colonna che consentono di individuare i componenti di una miscela. Si distinguono in rivelatori universali e selettivi, quest’ultimi consentono di individuare solo particolari categorie di composti. Il rivelatore ideale ha le seguenti caratteristiche: adeguata sensibilità buona stabilità e riproducibilità risposta lineare in un intervallo di parecchi ordini di grandezza tempo di risposta breve

27 Rivelatori a ionizzazione di fiamma (FID): E’ ampiamente utilizzato e di tipo universale. catodo anodo L’effluente della colonna viene direzionato in una fiamma aria/idrogeno. La maggior parte dei composti organici quando pirolizzati in tale fiamma producono ioni ed elettronii che generano una corrente elettrica (segnale) Vantaggi: buona sensibilità, range dinamico, robusto Svantaggi: metodo distruttivo; non sensibile a composti non idrocarburici come ad es. N 2, O 2, CO 2, NH 3

28 Rivelatori a conducibilità termica (TCD): Rivelatore “storico” e ancora adesso diffuso. E’ un esempio di rivelatore robusto e universale. Il rivelatore dipende da un elemento riscaldato elettricamente (filamento di tungsteno o platino), la cui temperatura dipende dalla conducibilità termica del gas che lo circonda. He e H 2 buona conducibilità termica. La presenza di analiti (organici e inorganici) riduce la conducibilità termica del gas con conseguente  temperatura filamento (segnale) Vantaggi: detector semplice e robusto, universale, range dinamico Svantaggi: bassa sensibilità

29 Rivelatori a cattura di elettroni (ECD): Risponde in maniera selettiva a composti organici contenenti alogeni. Il gas che entra nel rivelatore viene ionizzato da elettroni ad alta energia (radiazioni  ) emessi da una lamina contenente 63 Ni radioattivo. La ionizzazione del gas di trasporto (solitamente N 2 ) genera un flusso di elettroni attratti dall’anodo (corrente stazionaria). Quando le molecole dell’analita ad elevata affinità elettronica entrano nel rivelatore, catturano gli elettroni riducendo la corrente Vantaggi: sensibilità elevata per composti alogenati Svantaggi: non sensibile per ammine, alcoli e idrocarburi

30 Derivatizzazione in GC La derivatizazzione è un processo che permette di modificare chimicamente un composto (es. altobollente) al fine di ottenere un nuovo composto le cui proprietà chimico-fisiche sono compatibili con l’analisi GC La derivatizzazione permette le seguenti modifiche: - aumento la volatilità (elimina la presenza di gruppi polari come OH, SH, NH) - riduzione volatilità (permette l’analisi di composti volatili a basso peso molecolare difficili da maneggiare e che coeluiscono con il solvente) - aumenta la stabilità - aumenta la sensibilità (inserimento di gruppi alogenati per ECD) Le principali reazioni di derivatizzazione sono: Silanizzazione Alchilazione acilazione

31 Derivatizzazione mediante silanizzazione La reazione di silanizzazione produce composti volatili e stabili termicamente. In tale reazione l’H attivato viene sostituito con un gruppo trimetilsililico mediante una reazione di attacco nucleofilo (SN2; la reazione è guidata dal gruppo uscente) L’agente silanizzante più semplice è il trimetilclorosilano (CH 3 ) 3 -Si-Cl (TMS-Cl). La reattività del gruppo funzionale verso la silanizzazione il seguente: Alcoli (primario> secondario>terziario) > fenolo > carbossile > ammina> ammide TMS-Cl -OH -SH -COOH -NH 2 -NH CONH 2 -OTMS -STMS -COOTMS -NHTMS, N(TMS) 2 -NTMS CONHTMS

32 Dato che i reattivi reagiscono con H 2 O, è necessario usare solventi anidri (la piridina è il solvente più utilizzato) Le colonne caratterizzate da idrogeni attivi (CARBOVAX) non sono compatibili con questi derivatizzanti principali agenti silalizzanti (CH 3 ) 3 Si-imidazoloTMSIM (trimetilsililimidazolo) NB selettivo per OH, non reagisce con ammine (CH 3 ) 3 -Si-Cl (TMS-Cl). TMS-Cl TRIMETILCLOROSILANO (CH 3 ) 3 -Si-O-C(CH 3 )=N-Si(CH 3 ) 3 BSA (N,O-bis-trimetilsilil-acetamide) (CH 3 ) 3 -Si-N(C 2 H 5 ) 2 TMS-DEA (N-trimetilsilil-dietilamina)

33 Derivatizzazione mediante alchilazione La derivatizzazione mediante alchilazione riduce la polarità di molecole sostituendo idrogeni attivi con gruppi alchilici. La reazione si effettua con alogenuri alchilici o arilici, diazoalcani secondo le reazioni: R-NH 2 + 2Cl-R’  R-NR’ + 2HCl R-COOH + CH 2 N 2  RCOO-CH 3 + N 2 R-OH R-SH R-COOH R-NH 2 R-NH R-CONH 2 R-OR’ R-SR’ R-COOR’ R-NHR’ R-NR’ 2 R-COONR’ 2 Tra i principali agenti alchilanti: BF 3 in MeOH, dialchilacetali, pentafluorobenzilbromuri

34 Derivatizzazione mediante acilazione La reazione di acilazione riduce la polarità di gruppi amminici, idrossilici, tiolici e inserisce gruppi funzionali alogenati per ECD. La reazione di acilazione si utilizza per composti altamente polari come carboidrati e amino acidi. I reattivi utilizzati sono solitamente anidridi e alogenuri acilici I principali agenti derivatizzanti sono anidridi fluorinate (anidride pentafluoropropionica e eptafluorobutirrica)

35 Anidride trifluoroacetica

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38 Applicazione gas-cromatografia Analisi qualitativaAnalisi quantitativa Conferma presenza/assenza di un composto in una data miscela (necessità dello std.)

39 Analisi quantitativa in gas-cromatografia La gascromatografia è ampiamente usata per l’analisi quantitativa: l’altezza o l’area dei picchi è proporzionale con la quantità dei diversi componenti la miscela analizzata Esistono diversi metodi di misura della concentrazione tra cui: 1.Normalizzazione interna: è il metodo usato per determinare la composizione percentuale quando tutti i componenti della miscela sono rappresentati nel cromatogramma 2.Metodo della standardizzazione esterna: consente di determinare la concentrazione di uno o più componenti utilizzando lo std. e allestendo la curva di calibrazione 3.Aggiunta singola o multipla

40  In GC si preferisce l’uso di uno std. interno che consente analisi quantitative più accurate: tale tecnica prevede l’aggiunta di una molecola alla miscela da analizzare in quantità nota.  Curva di calibrazione: l’asse delle y non fa riferimento all’area del picco dell’analita ma al rapporto tra l’area del picco dell’analita e quella dello std. interno  Lo std. interno deve soddisfare i seguenti requisiti: - Non essere presente nella miscela da analizzare - Essere ben risolto dagli altri componenti - Avere un TR simile a quello dell’analita - Avere una concentrazione simile a quella dell’analita - Non contenere impurezze - Non reagire con il campione

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42 Applicazioni della GC in EU V ed. Determinazione titolo Identificazione e analisi quantitativa di droghe Determinazione quantitativa e semiquantitativa di impurezze Solventi residui Pesticidi

43 CHOLESTEROL Cholesterolum C 27 H 46 O M r 386.7 DEFINITION Cholesterol contains not less than 95.0 per cent of cholest-5-en-3β-ol and not less than 97.0 per cent and not more than 103.0 per cent of total sterols, calculated with reference to the dried substance. ASSAY Examine by gas chromatography (2.2.28), using pregnenolone isobutyrate CRS as the internal standard.2.2.28pregnenolone isobutyrate CRS Internal standard solution. Dissolve 0.100 g of pregnenolone isobutyrate CRS in heptane R and dilute to 100.0 ml with the same solvent.pregnenolone isobutyrate CRS heptane R Test solution. Dissolve 25.0 mg of the substance to be examined in the internal standard solution and dilute to 25.0 ml with the same solution. Reference solution. Dissolve 25.0 mg of cholesterol CRS in the internal standard solution and dilute to 25.0 ml with the same solution.cholesterol CRS

44 The chromatographic procedure may be carried out using: — a fused-silica column 30 m long and 0.25 mm in internal diameter coated with poly(dimethyl)siloxane R (film thickness 0.25 µm), poly(dimethyl)siloxane R — helium for chromatography R as the carrier gas with a split ratio of 1:25 at a flow rate of 2 ml/min,helium for chromatography R — a flame-ionisation detector, maintaining the temperature of the column at 275 °C, that of the injection port at 285 °C and that of the detector at 300 °C. Inject 1.0 µl of each solution. The assay is not valid unless the resolution between the peaks due to pregnenolone isobutyrate and cholest-5-en-3β-ol in the chromatogram obtained with the reference solution is at least 10.0. Calculate the percentage content of cholest-5-en-3β-ol, using the declared content of cholest-5-en-3β-ol in cholesterol CRS. Calculate the percentage content of total sterols by adding together the contents of cholest-5-en-3β-ol and other substances with a retention time less than or equal to 1.5 times the retention time of cholest-5-en-3β-ol. Disregard the peaks due to the internal standard and the solvent.cholesterol CRS

45 RRR-α-TOCOPHEROL RRR-α-Tocopherolum C 29 H 50 O 2 M r 430.7 DEFINITION (2R)-2,5,7,8-Tetramethyl-2-[(4R,8R)-4,8,12-trimethyltridecyl]-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-6-ol. Content: 94.5 per cent to 102.0 per cent. Related substances. Gas chromatography (2.2.28): use the normalisation procedure. Internal standard solution. Dissolve 1.0 g of squalane R in cyclohexane R and dilute to 100.0 ml with the same solvent. Test solution (a). Dissolve 0.100 g of the substance to be examined in 10.0 ml of the internal standard solution. Test solution (b). Dissolve 0.100 g of the substance to be examined in 10 ml of cyclohexane R. Reference solution (a). Dissolve 0.100 g of α-tocopherol CRS in 10.0 ml of the internal standard solution. Reference solution (b). Dissolve 10 mg of α-tocopherol R and 10 mg of α-tocopheryl acetate R in cyclohexane R and dilute to 100.0 ml with the same solvent.

46 Column: — material: fused silica; — size: l = 30 m, Ø = 0.25 mm; — stationary phase: poly(dimethyl)siloxane R (film thickness 0.25 µm). Carrier gas: helium for chromatography R. Flow rate: 1 ml/min. Split ratio: 1:100. Temperature: Time (min) Temperature (°C) Column0 - 15280 Injection port 290 Detector 290 Detection: flame ionisation. Injection: 1 µl of test solution (b) and reference solution (b). System suitability: reference solution (b): — resolution: minimum 3.5 between the peaks due to α-tocopherol and α- tocopheryl acetate. Limits: — total: maximum 4.0 per cent;

47 STAR ANISE OIL OIL Anisi stellati aetheroleum DEFINITION Essential oil obtained by steam distillation from the dry ripe fruits of Illicium verum Hook. fil. Chromatographic profile. Gas chromatography (2.2.28): use the normalisation procedure. Test solution. Dissolve 200 µl of the substance to be examined in 1.0 ml of hexane R. Reference solution. To 1.0 ml of hexane R, add 20 µl of linalol R, 20 µl of estragole R, 20 µl of α-terpineol R, 60 µl of anethole R and 30 µl of anisaldehyde R. Column: — material: fused silica, — size: l = 30 m, Ø = 0.25 mm, — stationary phase: macrogol 20 000 R (film thickness 0.25 µm). Carrier gas: helium for chromatography R. Flow rate: 1.0 ml/min. Split ratio: 1:100. Detection: flame ionisation. Injection: 0.2 µl.

48 — resolution: minimum 1.5 between the peaks due to estragole and α-terpineol. Using the retention times determined from the chromatogram obtained with the reference solution, locate the components of the reference solution in the chromatogram obtained with the test solution and locate cis-anethole and foeniculin using the chromatogram shown in Figure 2108.-1 (disregard any peak due to hexane). Determine the percentage content of these components. The percentages are within the following ranges: — linalol: 0.2 per cent to 2.5 per cent, — estragole: 0.5 per cent to 6.0 per cent, — α-terpineol: less than 0.3 per cent, — cis-anethole: 0.1 per cent to 0.5 per cent, — trans-anethole: 86 per cent to 93 per cent, — anisaldehyde: 0.1 per cent to 0.5 per cent, — foeniculin: 0.1 per cent to 3.0 per cent.

49 1.Linalol 3. α-terpineol 5. trans-anethole 7. foeniculin 2.estragole 4. cis-anethole6. anisaldehyde

50 5.4. RESIDUAL SOLVENTS SOLVENTS LIMITING RESIDUAL SOLVENT LEVELS IN ACTIVE SUBSTANCES, EXCIPIENTS AND MEDICINAL PRODUCTS The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) has adopted Impurities Guidelines for Residual Solvents which prescribes limits for the content of solvents which may remain in active substances, excipients and medicinal products after processing. This guideline, the text of which is reproduced below, excludes existing marketed products. The European Pharmacopoeia is, however, applying the same principles enshrined in the guideline to existing active substances, excipients and medicinal products whether or not they are the subject of a monograph of the Pharmacopoeia. All substances and products are to be tested for the content of solvents likely to be present in a substance or product.

51 Class 1 solvents: Solvents to be avoided Known human carcinogens, strongly suspected human carcinogens, and environmental hazards. Table 1. – Class 1 solvents in pharmaceutical products (solvents that should be avoided) SolventConcentration limit (ppm) Concern Benzene2Carcinogen Carbon tetrachloride4Toxic and environmental hazard 1,2-Dichloroethane5Toxic 1,1-Dichloroethene8Toxic 1,1,1-Trichloroethane

52 Class 2 solvents: Solvents to be limited Non-genotoxic animal carcinogens or possible causative agents of other irreversible toxicity such as neurotoxicity or teratogenicity. Solvents suspected of other significant but reversible toxicities. The concentration limits in ppm stated in Table 2 can be used. They were calculated using equation (1) below by assuming a product mass of 10 g administered daily.

53 Table 2. – Class 2 solvents in pharmaceutical products SolventPDE (mg/day) Concentration limit (ppm) Acetonitrile4.1410 Chlorobenzene3.6360 Chloroform0.660 Cyclohexane38.83880 1,2-Dichloroethene18.71870 Dichloromethane6.0600 1,2-Dimethoxyethane1.0100 N,N-Dimethylacetamide10.91090 N,N-Dimethylformamide8.8880 1,4-Dioxane3.8380 2-Ethoxyethanol1.6160 Ethyleneglycol6.2620

54 Formamide2.2220 Hexane2.9290 Methanol30.03000 2-Methoxyethanol0.550 Methylbutylketone0.550 Methylcyclohexane11.81180 N-Methylpyrrolidone5.3530 Nitromethane0.550 Pyridine2.0200 Sulfolane1.6160 Tetrahydrofuran7.2720 Tetralin1.0100 Toluene8.9890 1,1,2-Trichloroethene0.880 Xylene*21.72170 *usually 60 per cent m-xylene, 14 per cent p-xylene,9 per cent o-xylene

55 Class 3 solvents: Solvents with low toxic potential Solvents with low toxic potential to man; no health-based exposure limit is needed. Class 3 solvents have PDEs of 50 mg or more per day. Class 3 includes no solvent known as a human health hazard at levels normally accepted in pharmaceuticals. However, there are no long-term toxicity or carcinogenicity studies for many of the solvents in Class 3. Available data indicate that they are less toxic in acute or short-term studies and negative in genotoxicity studies. It is considered that amounts of these residual solvents of 50 mg per day or less (corresponding to 5000 ppm or 0.5 per cent under Option l) would be acceptable without justification. Higher amounts may also be acceptable provided they are realistic in relation to manufacturing capability and good manufacturing practice.

56 Table 3. – Class 3 solvents which should be limited by GMP or other quality-based requirements Acetic acidHeptane AcetoneIsobutyl acetate AnisoleIsopropyl acetate 1-ButanolMethyl acetate 2-Butanol3-Methyl-1-butanol Butyl acetateMethylethylketone tert-Butylmethyl etherMethylisobutylketone Cumene2-Methyl-l-propanol Dimethyl sulphoxidePentane Ethanol1-Pentanol Ethyl acetate1-Propanol Ethyl ether2-Propanol Ethyl formatePropyl acetate Formic acid

57 residui solventi

58 Il metodo di determinazione dei solventi residui prevede una analisi in spazio di testa Impurezze di solventi in una cefalosporina analizzata mediante spazio di testa (glicole etilenico come solvente)

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