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NEI SOLI USA CI SONO DA 6 A 80 MILIONI DI PERSONE OGNI ANNO COLPITI DA MALATTIE DI ORIGINE ALIMENTARE CON 9.000 DECESSI ED UN COSTO SOCIALE DI CIRCA 5.

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1 NEI SOLI USA CI SONO DA 6 A 80 MILIONI DI PERSONE OGNI ANNO COLPITI DA MALATTIE DI ORIGINE ALIMENTARE CON DECESSI ED UN COSTO SOCIALE DI CIRCA 5 MILIARDI DI DOLLARI

2 LO STUDIO DELLA MICROBIOLOGIA ALIMENTARE Provenienza e significato delle varie specie microbiche presenti Comportamento microbico durante i processi tecnologici Influenza durante la conservazione Particolari gruppi microbici che determinano linsorgenza di malattie

3 INFORMAZIONI RICAVATE DALLA MICROBIOLOGIA ALIMENTARE MICROBIOLOGIA ALIMENTARE Stabilire le fonti di contaminazione Valutare il rispetto delle norme igieniche Valutare le condizioni di conservazione Seguire lesatto susseguirsi di certi processi industriali Eliminare del commercio i prodotti contaminati

4 ESAME BATTERIOLOGICO DEGLI ALIMENTI Obiettivo primario: assicurare la tutela della salute del consumatore cioè dimostrare lassenza di germi patogeni Limiti distribuzione non omogenea dei batteri patogeni nel prodotto presenza di germi patogeni in basse concentrazioni presenza di agenti patogeni non batterici Questi limiti si possono in parte risolvere con: La ricerca di germi indice di contaminazione. Requisiti di un germe indice di contaminazione: avere la stessa nicchia ecologica del patogeno; avere la stessa modalità di trasmissione del patogeno; essere presente in numero elevato; essere facilmente rilevabile. Germi indice di contaminazione fecale 1) Coliformi 2) Enterococchi 3) Clostridi solfito-riduttori

5 Il nostro laboratorio batteriologico…

6 LE PROCEDURE BUROCRATICHE PER APRIRE UN NUOVO LABORATORIO DI ANALISI CHIMICHE

7 I principali permessi da richiedere alle autorità competenti: A. Idoneità dei locali di competenza del Comune (destinazione per esercizio commerciale) B. Adempimenti dei Vigili del Fuoco in riferimento alla presenza di solventi (D.P.R. 27 aprile 1955 n° 547)

8 I principali permessi da richiedere alle autorità competenti: C. Adempimenti per gli impianti elettrici di competenza del servizio Igiene e Ambiente della ASL (ex ENPI L. 46/90) D. Adempimenti per le sostanze radioattive di competenza delle Regioni ( L del )

9 I principali permessi da richiedere alle autorità competenti: E. Stoccaggio e preparazione di prodotti chimici di competenza delle ASL F. Stoccaggio e preparazione di additivi chimici per prodotti alimentari di competenza delle Regioni (DPR 327 del

10 I principali permessi da richiedere alle autorità competenti: G. Autorizzazione allo scarico di competenza comunale H. Smaltimento dei rifiuti (D.L.vo n° 22/97) I. Richiesta di emissione di fatture con IVA

11 Fattori che possono incidere sui risultati delle analisi microbiologiche: la preparazione specifica, lesperienza e linteresse dellanalista lidoneità delle apparecchiature ed il loro stato di manutenzione laccuratezza di preparazione dei terreni di coltura e la qualità dei loro componenti

12 Qualsiasi schema di analisi, anche se completo, dettagliato e ben eseguito, ha bisogno di un razionale criterio di campionamento. Questo perché i risultati ottenuti, dallesame di una sua aliquota, dovranno essere estrapolati ad un intero lotto o partita di alimento.

13 CAMPIONAMENTO a) Unità campionarie (o di campionamento = u.c.): singola aliquota o confezione di alimento, scelta casualmente e sulla quale si eseguiranno le opportune analisi; b) Lotto (o partita): con questo termine si intende, per convenzione, una quantità di alimento prodotta e confezionata in condizioni uniformi entro un limitato periodo di tempo (per esempio: giornata lavorativa, turno di lavoro, ecc.). Risulta evidente che quanto meno uniformi sono le condizioni di produzione, tanto minore deve essere, ai fini di una maggiore omogeneità, il suddetto lasso di tempo preso in considerazione ai fini del campionamento; c) Campione rappresentativo: quello le cui condizioni di produzione si avvicinino, sotto il profilo quali-quantitativo quanto più possibile a quelle di tutto il lotto dal quale è stato prelevato; d) Campione casuale: insieme di unità campionarie selezionate da un lotto precedentemente definito, seguendo un procedimento che assicuri ad ogni unità la medesima probabilità di essere prelevato.

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15 Piano di campionamento elaborato da I.C.M.F.S. (International Committee Microbiological Foods Standardization) I valori guida sono espressi dai seguenti simboli: m = indica il limite prefissato per una determinata caratteristica microbiologica dellalimento in esame. (es.: i valori di carica microbica saprofitaria) M = indica valori superiori a quello sopra indicato, non eccedenti tuttavia un determinato livello. c = indica il numero di aliquote componenti il campione in esame nei quali è consentito il raggiungimento dei valori indicati da M. n = indica le aliquote di prodotto componenti il campione in esame.

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17 Classificazione dei campioni in esame 1.ACCETTABILI: con valori inferiori ad m. 2. PARZIALMENTE ACCETTABILI: con valori compresi tra m e M. 3. INACCETTABILI: con valori superiori ad M. La severità di un piano di campionamento dipende direttamente dai valori che si attribuiscono ad n e c

18 Valori soglia [ oltre il quale possono insorgere tossinfezioni alimentari e malattie infettive ] AGENTE Livello soglia per popolaz. sana Salmonella <10 5 Tossina stafilococcica <1 mcg Clostridium perfrigens 10 6 Campylobacter Vibrio cholera 10 6 Shigella 10 1 – 10 2 H.A.V Yersinia 10 9 Norwalk virus 10

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20 Terreno di coltura AGAR: Estratto di alga rossa Solidifica a 42°C Non è digeribile Acqua Elementi nutrizionali Sostanze inibenti

21 Schema di controllo delle operazioni per la preparazione dei terreni di coltura

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23 Limpiego di metodi analitici non idonei può comportare il conseguimento di falsi risultati sia negativi che positivi. I primi costituiscono un problema di salute pubblica; i secondi producono ingiustificati danni di natura economica e giuridica.

24 Tecnica delle membrane filtranti

25 Membrane filtranti ENUMERAZIONE BATTERICA SVANTAGGI Eccessiva selettività dei terreni ( e temperature) Interferenza da materiale in sospensione ostruzione dei pori può provocare un film di crescita Più batteri formanti una colonia (U.F.C.) Errori di laboratorio bolle daria terreno scarso dischetti sommersi

26 Membrane filtranti VANTAGGI rapidità dei risultati (24/48 h) maggiore accuratezza e precisione riduzione dello spazio occupato < laboriosità di esecuzione esami di volume maggiori di acqua possibilità di rilevare la presenza di batteri diversi da quelli ricercati ENUMERAZIONE BATTERICA

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28 Tecnica per inclusione

29 ENUMERAZIONE BATTERICA Formula di Poisson: X = numero di germi stimato per ml Ci = totali germi contati per ogni diluizione Ni = piastre per diluizione Zi = diluizione

30 C 1 = conte batteriche con maggior numero di CFU C 2 = conte batteriche con minor numero di CFU VALUTAZIONE DELLATTENDIBILITA DELLA CONTA SECONDO LE MEDIE DI POISSON

31 Prova presuntiva Prova conclusiva conferma + -

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35 Indice MPN

36 ENUMERAZIONE BATTERICA Formula di Thomas per MPN P = numero di tubi positivi N = volume del campione nei tubi negativi T = volume totale del campione inoculato in tutti i tubi X = numero di germi per 100 ml

37 Tecnica MPN ENUMERAZIONE BATTERICA SVANTAGGI Metodica lenta (48-96 h) e laboriosa Procedimento costoso Manca di precisione nei risultati I risultati possono essere inficiati da fenomeni di interferenza dovuti alla presenza nel campione di: Flora microbica concorrente Elevata concentrazione di nitrati che inibisce lattacco fermentativo dei coliformi agli zuccheri (EFFETTO ANAEROGENICO)

38 D. lgs. n° 31 del 2 febbraio 2001 Attuazione della direttiva 98/83 CE relativa alle acque destinate al consumo umano

39 ISO (International Standardisation Organisation – Ente Mondiale di Normazione) CEN (Comitato Europeo di Normazione – Ente Europeo di Normazione) UNI (Ente Italiano di Normazione) UNI EN ISO 9000 ha emesso fin dal 1987 una famiglia di standard (NORME) che definiscono le prescrizioni da adottare in azienda per realizzare un SISTEMA di QUALITA: si tratta della famiglia di standard (ISO 9000) ha recepito le norme ISO come EN ISO In ITALIA le ha recepite come

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55 Definizione del campo di applicazione Confronto con un metodo di riferimento produttività selettività riproducibilità

56 Allestimento colture batteriche miste con germi interferenti Diluizione della coltura di partenza fino a concentrazioni leggibili Analisi con il metodo di riferimento lettura Conferma biochimica Calcolo della sensibilità e della specificità Analisi con il metodo di prova lettura Conferma biochimica Calcolo della sensibilità e della specificità Verifica delle differenze di recupero mediante analisi della regressione lineare Confronto della specificità e sensibilità mediante il test 2

57 Il nuovo protocollo viene applicato a campioni sottoposti ad analisi routinarie accanto al metodo tradizionale, con conseguente verifica dei risultati. Il nuovo protocollo viene applicato a campioni sottoposti ad analisi routinarie accanto al metodo tradizionale, con conseguente verifica dei risultati. Il metodo di riferimento viene sostituito con quello alternativo qualora i risultati ne comprovino la superiorità o lequivalenza. Tutta la documentazione viene archiviata.

58 Controllo microbiologico dellaria e delle superfici degli ambienti di lavorazione Campionatore daria Piastre da contatto

59 I microrganismi gram + (cocchi e bastoncelli) più interessanti per la microbiologia degli alimenti fanno parte delle seguenti famiglie e generi: Cocchi: fam. Micrococcaceae Gen. Micrococcus Gen. Staphylococcus Bastoncelli Gram + sporigeni Bastoncelli Gram + regolari non sporigeni Gen. Streptococcus Gen. Pediococcus Gen. Leuconostoc Gen. Bacillus Gen. Clostridium Gen. Lactobacillus Gen. Listeria Gen. Erysipelotrix Gen. Brochotrix Bastoncelli Gram + irregolari non sporigeni Gen. Corynebacterium Gen. Arthrobacter Gen. Brevibacterium Gen. Microbacterium Gen. Propionibacterium Gen. Bifidobacterium Bastoncelli Gram + irregolari non sporigeni Fam. MicobacteriaceaeGen. Mycobacterium

60 I microrganismi gram – di maggior interesse alimentare sono inclusi nelle seguenti famiglie: Fam. PseudomodaceaeGen. Pseudomonas Gen. Xantomonas Gen. Acetobacter Gen. Gluconobacter Gen. Flavobacterium Gen. Alteromonas Gen. Alcaligenes Gen. Brucella Gen. Chromobacterium Gen. Moraxella Gen. Acinetobacter Fam. Neisseriaceae Fam. VibrionaceaeGen. Aeromonas Gen. Vibrio Fam. SpirillaceaeGen. Campylobacter Fam. EnterobacteriaceaeGen. Escherichia Gen. Enterobacter Gen. Hafnia Gen. Citrobacter Gen. Klebsiella Gen. Erwinia Gen. Serratia Gen. Edwarsiella Poiché fermentano il lattosio vengono chiamati coliformi Gen. Salmonella Gen. Shigella Gen. Proteus Gen. Providencia Gen. Yersinia Non fermentano il lattosio

61 Lamponi del Guatemala Cyclospora cayetanensis Uova – latte – gelati Salmonella tiphimurium Uova di pollo Salmonella enteritidis Uova cotte allostrica Salmonella enteritidis Hamburgers Escherichia coli 0157:H7 Pollame – latte – acqua Campylobacter jejuni Fragole Epatite A Latte di cocco della Thailandia Vibrio colerae

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63 Coliformi totali Gruppo eterogeneo di cui fanno parte diversi gewneri quali: Arizona, citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella; in grado di fermentare il lattosio a 35 – 37°C. Non tutti i generi hanno habitat intestinale Coliformi termotolleranti Vi appartengono quei coliformi (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter) in grado di fermentare il lattosio a 44°C. Non tutti i generi hanno habitat intestinale Escherichia coli Specie in grado di fermentare il lattosio a 44°C e di produrre indolo in acqua peptonata. Habita intestinale. Enterococchi Hanno habitat fondamentalmente intestinale ma possono moltiplicarsi al di fuori di questo ambiente, sono più resistenti ai trattamenti di bonifica degli alimenti. Importanti nel controllo delle acque particolarmente quelle destinate alla molluschicoltura. Clostridi solfito-riduttori Germi sporigeni le cui spore possono ritrovarsi anche nellambiente esterno e sono resistenti ai trattamenti in grado di distruggere la maggior parte dei patogeni.

64 Escherichia coli Bacillo Gram (-) asporigeno appartenente alle Enterobacteriacee. Fa parte della normale fora intestinale. Alcune specie possono essere patogene per la produzione di tossine. È considerato indicatore di contaminazione fecale. PARAMETRI MICROBIOLOGICI

65 Streptococchi fecali Cocchi Gram (+) con tendenza a disporsi a catena; aerobi anaerobi facoltativi del genere Enterococcus. Si trovano nel tratto gastrointestinale di animali a sangue caldo. Sono considerati indicatori di contaminazione. PARAMETRI MICROBIOLOGICI

66 Conta totale a 37°C Tutti i batteri in grado di svilupparsi a 37°C. Sono importanti in quanto appartengono per lo più a germi della flora fecale umana o animale. PARAMETRI MICROBIOLOGICI

67 bastoncelli Gram (-) aerobi oanaerobi facoltativi, appartengono alla famiglia delle Enterobacteriacee. Batteri lattosio fermentanti con produzione di gas. Presenti nel materiale fecale di origine umana (10 8 UFC/g). Sono considerati indicatori di contaminazione in atto. Devono risultare assenti in 100 ml di acqua

68 bastoncelli Gram (-) aerobi o anaerobi facoltativi, appartengono alla famiglia delle Enterobacteriacee. Batteri lattosio fermentanti con produzione di gas. Presenti nel materiale fecale di origine umana (109 UFC/g), colonizzano il suolo,aria acqua, vegetazione. Sono considerati indicatori di contaminazione in atto. Devono risultare assenti in 100 ml di acqua

69 cocchi Gram (+) con tendenza a disporsi a catena aerobi anaerobi facoltativi del genere Enterococcus. Si trovano nel tratto gastrointestinale di animali a sangue caldo. Devono risultare assenti in 100 ml di acqua Gli streptococchi fecali si moltiplicano raramente nelle acque inquinate e sono più persistenti di E. coli e dei batteri coliformi. Il loro valore primario per lesame della qualità dellacqua è perciò quello di indicatori aggiuntivi. Inoltre gli streptococchi sono altamente resistenti allessiccamento e possono essere utili per il rilevare la contaminazione di acque sotterranee o superficiali causata dal dilavamento del suolo.

70 Sono organismi anaerobi e sporigeni, il più caratteristico dei quali C. perfrigens è normalmemte presente nelle feci, sebbene in numeri molto minori di E. coli. Tuttavia i clostridi non hanno esclusivamente una origine fecale e possono derivare da altre fonti ambientali. Le spore dei clostridi possono sopravvivere in acqua molto più a lungo degli organismi del gruppo dei coliformi e inoltre resistono alla disinfezione. a causa della loro longevità, trovano il loro impiego migliore come indicatori di contaminazione intermittente o remota. Poiché tendo a sopravvivere e ad accumularsi, possono essere rilevabili per lungo tempo dopo la contaminazione e in punti distanti dalla fonte contaminante.

71 E unospite normale dellorganismo umano di cui rappresenta la specie predominante nella popolazione batterica residente nellintestino. Si ritrova nelle acque di scarico, negli effluenti trattati e nei suoli sottoposti a contaminazioni fecali recenti, dovuti alluomo, agli animali da allevamento e selvatici, agli uccelli. La sua presenza nellacqua può essere considerata indizio sicuro di contaminazione fecale. E lagente eziologico più frequente ed importante di infezioni delle vie urinarie e alcuni stipiti sono agenti eziologici di enteriti


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