La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) Test diagnostici di Laboratorio Valeria Ghisetti e Giovanna Marchiaro S.C. Microbiologia ASO San Giovanni Battista.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) Test diagnostici di Laboratorio Valeria Ghisetti e Giovanna Marchiaro S.C. Microbiologia ASO San Giovanni Battista."— Transcript della presentazione:

1 Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) Test diagnostici di Laboratorio Valeria Ghisetti e Giovanna Marchiaro S.C. Microbiologia ASO San Giovanni Battista - Molinette

2 WHO”global allert”  2 settimane per identificare il virus  2 settimane per sequenziare il genoma e stabilire la filogenesi di SARS-CoV Inizio anni ’80 AIDS 2 anni per identificare HIV Inizio 2003 SARS 4 settimane per SARS-CoV

3 WHO WHO”global allert” marzo 2003 Invio di materiali biologici sangue,siero escreato tamponi faringei e nasofaringei materiale autoptico 13 laboratori di riferimento in 10 paesi (richiesto BSL 3) NHI mobilita 300 ricercatori del CDC UN & CDC Media WHO Regional & Country Offices National Disease Control Centres Electronic Discussions

4 SARS-CoV: agente eziologico di SARS Ordine: Nidovirales Famiglia: Coronaviridae Genere: Coronavirus Species : SARS-CoV  Virus “giganti” : Il genoma consta di ~ nt  HIV ~ nt, HBV ~ nt Virus ad RNA+ (RNA: mRNA) Alta variabilità genetica “corona”: proteina S legante il recettore e epitopi neutralizzanti

5 Gruppo I Virus della gastroenterite suina Coronavirus umano229E Coronavirus della peritonite del gatto Coronavirus del cane Gruppo II Virus dell’epatite dei topi Virus della sialoadenite dei ratti Virus dell’encefalite suina Coronavirus umano OC43 Coronavirus dei bovini Gruppo III Virus della bronchite degli uccelli Coronavirus dei tacchini SARS-CoV

6 SARS : criteri di diagnosi  Criteri clinici  Criteri epidemiologici Criteri di laboratorio  conferma diagnosi di SARS  esclusione diagnosi di SARS CDC, MMWR, 2003, 52

7 Criteri di laboratorio per definire l’infezione da SARS-CoV  Diagnosi di SARS confermata Isolamento in coltura di SARS-CoV Identificazione del genoma di SARS-CoV mediante test molecolare di RT-PCR (validato da OMS e CDC) Presenza di anticorpi anti-SARS-CoV nella fase acuta o dopo 21 giorni dall’esordio (test sierologici validati da OMS e CDC)  Diagnosi di esclusione di SARS Diagnosi alternativa (altro agente patogeno) che spieghi il quadro clinico Assenza di anticorpi anti-SARS-CoV nel siero prelevato nella fase di convalescenza (>21 giorni dall’esordio) CDC, MMWR, 2003, 52

8 Isolamento in colture cellulari Microscopia elettronica Virioni tipo Coronavirus Identificazione con pool di anticorpi policlonali per Coronavirus (35-40 antisieri) Identificazione di SARS-CoV Effetto citopatico Giorni 3-5 Vero E6 Materiali Biologici Drosten,et al. NEJM, 2003; 348, 20 Ksiazek et al. NEJM, 2003, 348:20 Risultati in piu’ giorni Diagnosi rapida Analisi molecolari Risultati in <1 giorno

9 Polymerase Chain Reaction (PCR) Numero di cicli Numero di molecole ottenute Y= x2 n Y= numero molecole di DNA amplificato x= numero molecole di DNA di partenza n= numero dei cicli di PCR DNA denaturation Primers annealing & extention Amplification Sequence to be amplified Taq n cicl.... Risultati in <1 giorno

10 Quantizzazione SARS-CoV Sensibilità 1-10 copie 6 ore Real time PCR cycles

11 Diagnosi rapida di SARS-CoV S.C. Microbiologia, ASO San Giovanni Battista - Molinette Estrazione RNA Retrotrascrizione RNA-cDNA Real time PCR multiplex controllo interno di competenza DNA 6 ore Real-Time RT-PCR secondo validazione OMS e CDC

12 Identificazione di SARS-CoV sensibilità clinica dei test Pazienti con campioni positivi/pazienti totali affetti da SARS RT-PCRIsolamento in coltura Sierologia 15/17*5/177/17 *i due casi RT-PCR negativi (tamponi orofaringei) presentavano anticorpi specifici contro SARS-CoV Ksiazek et al. NEJM, 2003, 348:20 Campioni: Lavaggio orofaringeo (n=13) Tampone nasale (n=5) Bal (n=1) Escreato (n=2) Aspirato midollare (n=1) Biopsia polmonare (n=2) Biopsia renale (n=1)

13 Analisi molecolare di SARS-CoV  Criteri di validazione del test di PCR Test ripetutamente positivo (almeno 2 volte) sullo stesso campione Test positivo su due campioni differenti es. tampone nasofaringeo e feci/sangue Test positivo su due campioni provenienti dallo stesso sito ma raccolti a distanza di 1- 2 giorni CDC, MMWR, 2003, 52

14 Campioni biologici per i test di laboratorio in caso di sospetta SARS  Materiali provenienti dalle vie respiratorie superiori Lavaggi/aspirati naso e orofaringei Tamponi naso-faringei e oro-faringei Escreato  Materiali provenienti dalle vie respiratorie inferiori Lavaggio bronco-alveolare Broncoaspirato e aspirato tracheale Liquido pleurico  Sangue Sangue intero Siero per dosaggio anticorpale  Due prelievi : uno in fase acuta e uno nella fase di convalescenza (>21 giorni dall’esordio) CDC, MMWR, 2003, 52

15 Carica virale di SARS-CoV nei diversi materiali: studio di un caso indice MaterialeGiorno dall’esordio RT-PCR nested Real-time PCR Carica virale/ml Surnatante colture + 8.3x10 6 Escreato x10 4 Tampone orofaringeo <800 Tampone nasofaringeo <800 Plasma BAL x10 5 Feci ND Drosten,et al. NEJM, 2003, 348:20

16 Riconoscimento dell’eziologia di SARS Esclusione dei patogeni respiratori e di altri patogeni che possono interessare le basse vie respiratorie  Yersinia  Mycoplasma  Chlamydia  Legionella  Coxiella burneti  Rickettsiae  Virus dell’influenza A e B  Paramyxoviridae  RSV e metapneumovirus  Mastadenoviridae  Herpetoviridae  Hantavirus  Picornaviridae  Arenavirus BSL 3 Agenti di bioterrorismo Metodiche tradizionali Colture microbiologiche Colture cellulari Indagini sierologiche Inoculazione in topi Microscopia elettronica Metodiche molecolari Ksiazek et al. NEJM, 2003, 348:20 Drosten,et al. NEJM, 2003; 348, 20,

17  Anticorpi positivi a +10 giorni dall’infezione crescita lenta  Un singolo test positivo e’ indicativo di infezione acuta/recente richiesto il dosaggio delle IgM e/o la valutazione dell’incremento (almeno 4 volte) del titolo anticorpale  Un test negativo non esclude SARS  Esclusione di SARS : assenza di anticorpi specifici in siero convalescente (>21 giorni dopo l’insorgenza della malattia) Test sierologici per SARS-CoV caratteristiche e limiti SARS-CoV non ha mai circolato nell’uomo IFA disponibile commercialmente per Ab totali CDC, MMWR, 2003, 52

18 SARS: aspetti organizzativi del Laboratorio  BSL 3 per manipolazione dei campioni  Personale specializzato e addestrato ad hoc biologi e tecnici molecolari  Turni di pronta disponibilità specifica

19 Variabilità genetica di SARS-CoV Ibrido  da fenomeni di ricombinazione genetica che occorrono naturalmente 10% di fenomeni di ricombinazione genetica nello stesso virus animali coinfettati da due Coronavirus producono una progenie per il 50% costituita da ricombinanti colture cellulari : ceppi ricombinanti ogni 5 milioni di cellule infettate o transfettate Salto di specie  da animale a uomo Coronavirus animale che ha trovato nell’uomo un ambiente favorevole (assenza di immunita’) Di che animale si tratta?? Da dove viene SARS-CoV ?

20 Analisi molecolare delle varianti virali 1-Analisi delle sequenze nucleotidiche similitudine di SARS-CoV: (nt) e (aa) Confronto sequenze nucleotidiche e aminoacidiche dei diversi gruppi di Coronavirus Albero filogenetico di SARS-CoV SARS-CoV e’ un Coronavirus diverso da quelli noti

21 Analisi molecolare delle varianti virali 2- Microarray & Microchips Enormi potenzialità nell’identificare nuovi agenti patogeni (Bioterrorismo) e nuove varianti virali farmacoresistenti (HIV e Micobatteri) Costi molto elevati..... Due tipi di disegno Due tipi di disegno :  sonde specifiche per ogni possibile variante di un gene es.gene POL per mutazioni di RT di HIV  sonde specifiche per ogni singola variante virale es. sonde specifiche per i diversi Coronavirus

22 Individuo suscettibile Migliore comprensione della biologia virale Biologia Molecolare Scenario Migliori strategie per la diagnosi e il controllo delle infezioni virali RNA/DNA Tecniche di manipolazione genetica  Nuovi vaccini  Salto di specie? HIV 1 e 2 Il virus Hendra Il virus Nipah Il virus dell’influenza A H5N1 SARS-CoV?  Bioterrorismo? Tecniche di manipolazione genetica  Nuovi vaccini  Salto di specie? HIV 1 e 2 Il virus Hendra Il virus Nipah Il virus dell’influenza A H5N1 SARS-CoV?  Bioterrorismo?


Scaricare ppt "Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) Test diagnostici di Laboratorio Valeria Ghisetti e Giovanna Marchiaro S.C. Microbiologia ASO San Giovanni Battista."

Presentazioni simili


Annunci Google