La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

Approccio sperimentale allo studio di una patologia neurodegenerativa: la SLA. Marco Peviani Laboratorio di Neurobiologia Molecolare Dipartimento di Neuroscienze.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "Approccio sperimentale allo studio di una patologia neurodegenerativa: la SLA. Marco Peviani Laboratorio di Neurobiologia Molecolare Dipartimento di Neuroscienze."— Transcript della presentazione:

1 Approccio sperimentale allo studio di una patologia neurodegenerativa: la SLA. Marco Peviani Laboratorio di Neurobiologia Molecolare Dipartimento di Neuroscienze Marco Peviani Laboratorio di Neurobiologia Molecolare Dipartimento di Neuroscienze Corso Animal Care, 2006

2 Patologia neurodegenerativa: Sclerosi Laterale Amiotrofica Animale da laboratorio / modello di patologia  La caratterizzazione del modello  Vantaggi  Limiti  Esempi applicativi

3 Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) Patologia neurodegenerativa progressiva MALATTIE DEL MOTONEURONE Morbo di Lou Gehrig

4 Farmaci disponibili:  Riluzolo Incidenza: 1-3 / 100’000 Prevalenza:4-6 / 100’000 Sintomatologia:  Debolezza muscolare, fascicolazioni, iperriflessia  Difficoltà nella deglutizione e nell’articolazione del linguaggio  Progressivo peggioramento dell’atrofia muscolare, infine paralisi  Morte / Insufficienza respiratoria (muscoli toracici / diaframma) Onset: 4^ – 5^ decade di vita Sopravvivenza: 3-5 anni dalla diagnosi Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA)

5 Epidemiologia

6 ALS1

7 INDAGINI ISTOPATOLOGICHE Medonca et al., Neur.Letters 2006 Migheli et al., Nature 1999

8 Cosa determina la morte del motoneurone?

9 Patologia neurodegenerativa  difficoltà per eseguire analisi / campioni post mortem Patologia progressiva  cosa succede nel sistema nervoso durante il decorso della malattia? esistono alterazioni già a tempi precoci? Quando compaiono? cosa fa scatenare la malattia? esiste un punto in cui la neurodegenerazione è ancora reversibile? Patologia progressiva  cosa succede nel sistema nervoso durante il decorso della malattia? esistono alterazioni già a tempi precoci? Quando compaiono? cosa fa scatenare la malattia? esiste un punto in cui la neurodegenerazione è ancora reversibile? Patologia rara  difficoltà nel reperire casi da analizzare / trattare Terapie  non esistono terapie efficaci

10 Modello murino di SLA SOD1 G93A (gene umano) Topo SOD1G93A

11

12 Utilità del modello Patologia neurodegenerativa  difficoltà per eseguire analisi / campioni post mortem Patologia cronica  cosa succede nel sistema nervoso durante il decorso della malattia? esistono alterazioni già a tempi precoci? Quando compaiono? cosa fa scatenare la malattia? esiste un punto in cui la neurodegenerazione è ancora reversibile? Patologia cronica  cosa succede nel sistema nervoso durante il decorso della malattia? esistono alterazioni già a tempi precoci? Quando compaiono? cosa fa scatenare la malattia? esiste un punto in cui la neurodegenerazione è ancora reversibile? MODELLO ANIMALE - possibilità di reperire campioni durante il corso della patologia - possibilità di eseguire analisi a tempi precoci (prima dell’insorgenza dei sintomi) - analisi dei meccanismi molecolari a base della malattia MODELLO ANIMALE - possibilità di reperire campioni durante il corso della patologia - possibilità di eseguire analisi a tempi precoci (prima dell’insorgenza dei sintomi) - analisi dei meccanismi molecolari a base della malattia

13 Birth Death Days 170 Osservazione del fenotipo patologico Paralisi Alterazioni EMG Tremori Riduzione tono muscolare Deficit respiratori

14 Analisi comportamento motorio A partire da 70 giorni 2 volte alla settimana Test parametrici  Misurazione di parametri quantitativi (peso/tempo/lunghezza…) Test non parametrici  Attribuzione di punteggi (scores) sulla base di una osservazione del fenotipo Links: SITO JACKSON LAB.  Homepage: SITO ISOGENIC.INFO SITO eumorphia EMPReSS

15 Stadio non sintomatico Stadio avanzato della malatia 1.Lymbs adduction test (Tail suspension test / Extension reflex) 1.Lymbs adduction test (Tail suspension test / Extension reflex) Punteggio:30 Non parametrico

16 2. Peso corporeo (grammi) Parametrico

17 3. Rotarod test (secondi) Parametrico Accelerazione costante

18 3. Rotarod test (secondi) Parametrico

19 Luce Buio 4. Gait performance (centimetri) Parametrico

20 5. Test della griglia (secondi) Parametrico

21 5. Test della griglia (secondi) Parametrico

22 6. Sopravvivenza (giorni) Parametrico

23 Prelievo tessuti Colture cellulari primarie Trattamenti in vivo Incrocio con altri animali transgenici

24 Birth Death Days 170 Impairment “test della griglia” Deficit “lymbs adduction test” Impairment “Rotarod test” Gait impairment Alterazioni EMG Tremori Paralisi Riduzione tono muscolare Pre-sympt. stage Sympt. stage End stage Prelievo tessuti

25 Tessuti fissati Tessuti freschi Analisi biochimiche  Western/ Northern/ RT-PCR…  proteomica  cinetiche enzimatiche Analisi istopatologiche  conta dei motoneuroni  micr. elettronico Analisi di IHC  distribuzione di proteine di interesse

26 Accumulo di SOD1 mutata nel midollo spinale dei topi SOD1G93A al progredire della patologia Cheroni et al., Neur.Dis Analisi biochimica Analisi proteomica degli aggregati di SOD1 Triton-insolubili, che si accumulano nei topi SOD1G93A Basso et al., JBC 2005 Attivazione di p38MAPK (fosforilazione) nel midollo spinale dei topi SOD1G93A Tortarolo, Veglianese et al., MCN 2003

27 Comparsa di vacuoli e mitocondri con struttura alterata nei motoneuroni dei topi SOD1G93A, già a tempi precoci Bendotti et al., J.Neur.Sc Analisi al microscopio elettronico

28 Attivazione di p38 MAPK nei motoneuroni dei topi SOD1G93A già a tempi precoci/colocalizzazione di p38 attivata con i motoneuroni che mostrano segni di degenerazione Tortarolo, Veglianese et al., MCN 2003 Analisi della distribuzione di proteine di interesse

29 Up-regolazione di TNFa-R1 e TNFa-R2 nei motoneuroni dei topi SOD1G93A già a tempi precoci Veglianese et al., MCN 2005

30 Colture cellulari primarie neuroni astrociti microglia Co-colture Screening di molecole potenzialmente terapeutiche

31 Tortarolo, Spaltro – Lab. Bendotti

32 Incrocio con altri animali transgenici Ipotesi di meccanismo patologico Identificazione proteina/pathway target Ruolo nella patologia? X Miglioramento? Modifica? TOPO SOD1G93A Animale transgenico con up-regolazione della proteina/pathway Animale transgenico privato della proteina (KNOCK-OUT ) Animale transgenico come “tool di rilevazione”

33 Incrocio con topi Knock-out per: TNFa (pathway neuroinf.) Gowing et al., Neur.Dis Rai (pathway anti-apoptotico) Peviani, Cheroni - Lab. Bendotti TNFa-R (pathway neuroinf.) Daleno - Lab. Bendotti Tools Topi NFL-YFP (Neurofilamenti) Topi Ub-GFP (pathway proteasoma) Cheroni – Lab. Bendotti Incrocio con topi transgenici per: XIAP (pathway anti-apoptotico) Wootz et al., Exp.Cell.Res. 2006

34 Trattamenti in vivo Neuroprotective agents for clinical trials in ALS Traynor et al., Neurology 2006 Targets in ALS: designing multidrug therapies Carrì, Grignaschi, Bendotti, TRENDS in Pharm. Sc (USA) (Europa)

35 Trattamenti nel modello animale Somministrazione cellule staminali

36 Limiti del modello Il roditore è un organismo diverso da quello umano - Diversa anatomia (anche nel SNC) - Diversa fisiologia - Diverse dimensioni - Diversa anatomia (anche nel SNC) - Diversa fisiologia - Diverse dimensioni Gli animali da laboratorio non sono tutti uguali - Differenze tra ceppi in-bred e ceppi out-bred - Ceppi in-bred diversi hanno caratteristiche diverse -[ Differenze di sesso (M/F)] - Differenze tra ceppi in-bred e ceppi out-bred - Ceppi in-bred diversi hanno caratteristiche diverse -[ Differenze di sesso (M/F)] Topo SOD1G93A vs UOMO  UOMO (ALS1): mutazione in un allele della SOD1  patologia  TOPO: serve overespressione della SOD1mutata per avere patologia (TOPO SOD1G93A – 20 copie del gene) Topo SOD1G93A vs UOMO  UOMO (ALS1): mutazione in un allele della SOD1  patologia  TOPO: serve overespressione della SOD1mutata per avere patologia (TOPO SOD1G93A – 20 copie del gene)   Topo SOD1 wild-type   Modello con nr. < di copie   Confronto con altri modelli (diverse mutazioni SOD; diverso transgene)   Topo SOD1 wild-type   Modello con nr. < di copie   Confronto con altri modelli (diverse mutazioni SOD; diverso transgene)

37 Patologia umana Modello animale Limiti Validazione Informazioni Test ipotesi Identificazione targets TERAPIA Altri modelliAltri sistemi Limiti


Scaricare ppt "Approccio sperimentale allo studio di una patologia neurodegenerativa: la SLA. Marco Peviani Laboratorio di Neurobiologia Molecolare Dipartimento di Neuroscienze."

Presentazioni simili


Annunci Google