IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte,

Presentazione sul tema: "IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte,"— Transcript della presentazione:

1 IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta VII WORKSHOP DEL LABORATORIO NAZIONALE DI RIFERIMENTO (NRL) PER GLI STAFILOCOCCHI COAGULASI POSITIVI COMPRESO S.AUREUS 18 dicembre 2014 Caratterizzazione dei ceppi: analisi disponibili presso il nostro LNR e nuove metodiche in studio Guerrino Macori National Reference Laboratory for Coagulase Positive Staphylococci including S.aureus – Torino

2 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Principali metodi di caratterizzazione Caratterizzazione biologica Caratterizzazione sierologica Caratterizzazione molecolare consiste nell’individuare e confrontare i sintomi di un agente infettante impiegandolo come indicatore su sistemi biologici indicatori Si avvale dell’uso di anticorpi Immunodiffusione ELISA e altri metodi che utilizzano questo principio Identificazione molecolare: PCR, PFGE VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

3 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Biotipizzazione (Devriese, 1984) Sistema di Biotipizzazione Presenza di Stafilochinasi Coagulazione plasma bovino Tipo di crescita al cristal violetto -emolisi (Devriese, 1984) VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

4 Biotipizzazione (Devriese, 1984)
Identificazione ospite di origine Specificità d’ospite: Umano/Bovino/Ovino Non Specificità d’ospite: NHS1 -> NHS6 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

5 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Biotipizzazione (Devriese, 1984) VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

6 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Tipizzazione S.aureus Biotipizzazione VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

7 Hennekinne et al, 2012 - EURL review in ESs
Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs Ad oggi sono state identificate 21 SEs: 5 SEs (SEA-SEE) [reg 1441] e 16 nuove tossine Hennekinne et al, EURL review in ESs VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

8 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs La distribuzione dei geni che codificano per le ES genoma di S.aureus molto variabile EGC e altri MGEs Batteriofagi SaPIs Plasmidi Trasposoni VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

9 Caratterizzazione “potenziale tossigenico”
Protocollo 2 seg, seh, sei, sej, sep Protocollo 1 sea, seb, sec, sed, see, ser Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

10 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs Isolamento Estrazione Amplificazione Rivelazione VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

11 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs Campionamento Gennaio Dicembre 2013 823 campioni latte e derivati Territorio Piemonte - Torino CPS [ISO :1999/Amd 1:2003] Identificazione Card GP –VITEK; alcuni casi Real Time TaqMan® Staphylococcus aureus Detection Kit [Merker, et al., 2000] VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

12 Caratterizzazione “potenziale tossigenico”
Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs Campionamento S. aureus isolato in 180 campioni (22%) di latte e prodotti caseari; 144/645 (22%) e 36/158 (20%). Latte 22% 22% Prodotti 20% 823 campioni VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

13 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs Ricerca 11 geni SEs 85 almeno un gene codificante per SEs; distribuzione geni ha permesso di delineare 14 differenti profili genetici. sed-ser-sej (36%) seg-sei (25%) d r j 31 g i 21 a 8 c h 4 3 2 1 p 12 10 41 25 5 26 42 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

14 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

15 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Tipizzazione geni SEs Biotipizzazione VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

16 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Elettroforesi in campo pulsato (PFGE)  PFGE è una tecnica di caratterizzazione molecolare principio della tecnica: azione degli enzimi di restrizione su un intero genoma 10-20 frammenti di restrizione (da 10 kb a kb) VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

17 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) Incorporazione coltura batterica in agarosio  Digestione enzimatica smaI Separazione elettroforetica dei frammenti Lettura del gel Anali e interpretazione dei profili CHEF MAPPER Modalità Multi State: (Volts/cm = 6, Included Angle = “+60/-60” Ramping Factor = A “Linear”) Block 1(Blk1) State 1 (St01) [6.0] V/cm a= [linear] Ang = [+ 60] InTm = [5 seconds] FnTm = [15 seconds] Block 1(Blk1) State 2 (St02) [6.0] V/cm a= [linear] Ang = [- 60] InTm = [5 seconds] FnTm = [15 seconds] Migration Time 8 Hours Block 2 (Blk2) State 1 (St01) [6.0] V/cm a= [linear] Ang = [+ 60] InTm = [15 seconds] FnTm = [60 seconds] Block 2 (Blk1) State 2 (St02) [6.0] V/cm a= [linear] Ang = [- 60] InTm = [15 seconds] FnTm = [60 seconds] Migration Time 11 Hours Nel caso si disponga di CHEF DR III impostare lo strumento come segue: Volts/cm = 6, Included Angle = 120 Block 1(Blk1) [6.0] V/cm InTm [5 seconds] FnTm = [15 seconds] Migration Time 8,5 Hours Block 2 (Blk2) InTm = [15 seconds] FnTm = [60 seconds] Migration Time 11,5Hours vs VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

18 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) Analisi e interpretazione dei profili VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

19 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) Vantaggi Subtyping Alta discriminazione  DNA restriction patterns stabili e riproducibili intra- e inter-laboratorio Indagini epidemiologiche e casi di MTA Svantaggi Alta specializzazione Time-consuming Elevati costi Isolati non tipizzabili (non nel caso di S.aureus) VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

20 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

21 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
PFGE Tipizzazione geni SEs Biotipizzazione VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

22 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Spa-tipizzazione Staphylococcus aureus Protein A - Typing Sequenza di una porzione VNTR polimorfica nella regione codificante specifica di S.aureus della proteina A stafilococcica. Presenza di molte sequenze ripetute e variabili da ceppo a ceppo ma molto conservate all’interno della specie. Le sequenze ripetute vengono chiamate “sequenze repeat” (circa bp di solito 24) VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

23 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Spa-tipizzazione Staphylococcus aureus Protein A - Typing E’ una tecnica di tipizzazione a “singolo locus”, offre una risoluzione di subtyping paragonabile a tecniche più costose e/o laboriose, come MLST e PFGE. Online based – inserimento 4 spatipi nel 2014 Non è un protocollo inserito nel sistema qualità! Pubblicazioni in corso Redazione e distribuzione (2015?) VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

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Spa-typing PFGE Tipizzazione geni SEs Biotipizzazione VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

25 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Ulteriori livelli di tipizzazione Multi Locus Sequence Typing (MLST) A differenza di spa-typing MLST è una tecnica di tipizzazione a “locus multiplo”, offre una risoluzione di subtyping più profonda: Geni ulteriori sequenziati: • arc (Carbamate kinase) • aro (Shikimate dehydrogenase) • glp (Glycerol kinase) • gmk (Guanylate kinase) • pta (Phosphate acetyltransferase) • tpi (Triosephosphate isomerase) • yqi (Acetyle coenzyme A acetyltransferase) Attività 2015 pianificata ampliamento VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

26 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
MLST Spa-typing PFGE Tipizzazione geni SEs Biotipizzazione VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

27 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
…. … MLST Spa-typing PFGE Tipizzazione geni SEs Biotipizzazione Combinazione molecolare/biotipi zzazione e geni virulenza Altri polimorfismi Analisi dei complessi clonali MALDI-TOF RS-PCR “Genotipi” (Graber et al., Tipizzazione del batteriofago pvl Ribotyping VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

28 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Ulteriori livelli di tipizzazione Whole genome sequencing “A prerequisite to understanding the complete biology of an organism is the determination of its entire genome sequence” Fleischmann et al. 1995 Sequenza lineare dell’intero genoma – A T C G- Is the Sequence sufficient to understand biological function of the organisms? VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

29 Ulteriori livelli di tipizzazione
Whole genome sequencing Recente acquisizione miSeq VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

30 MLST PFGE Spa-typing Tipizzazione geni SEs Whole genome sequencing ….
Biotipizzazione VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

31 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013
Grazie per l’attenzione! VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013