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Guerrino Macori National Reference Laboratory for Coagulase Positive Staphylococci including S.aureus – Torino VII WORKSHOP DEL LABORATORIO NAZIONALE DI.

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Presentazione sul tema: "Guerrino Macori National Reference Laboratory for Coagulase Positive Staphylococci including S.aureus – Torino VII WORKSHOP DEL LABORATORIO NAZIONALE DI."— Transcript della presentazione:

1 Guerrino Macori National Reference Laboratory for Coagulase Positive Staphylococci including S.aureus – Torino VII WORKSHOP DEL LABORATORIO NAZIONALE DI RIFERIMENTO (NRL) PER GLI STAFILOCOCCHI COAGULASI POSITIVI COMPRESO S.AUREUS 18 dicembre 2014 Caratterizzazione dei ceppi: analisi disponibili presso il nostro LNR e nuove metodiche in studio IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta

2 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Principali metodi di caratterizzazione Caratterizzazione biologica Caratterizzazione sierologica Caratterizzazione molecolare Caratterizzazione biologica consiste nell’individuare e confrontare i sintomi di un agente infettante impiegandolo come indicatore su sistemi biologici indicatori Caratterizzazione sierologica Si avvale dell’uso di anticorpi Immunodiffusione ELISA e altri metodi che utilizzano questo principio Caratterizzazione molecolare Identificazione molecolare: PCR, PFGE

3 Sistema di Biotipizzazione 1.Presenza di Stafilochinasi 2.Coagulazione plasma bovino 3.Tipo di crescita al cristal violetto 4.  -emolisi (Devriese, 1984) VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Biotipizzazione (Devriese, 1984)

4 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Identificazione ospite di origine Specificità d’ospite : Umano/Bovino/Ovino Non Specificità d’ospite : NHS1 -> NHS6 Biotipizzazione (Devriese, 1984)

5 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Biotipizzazione (Devriese, 1984)

6 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Tipizzazione S.aureus

7 Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Ad oggi sono state identificate 21 SEs: 5 SEs (SEA-SEE) [reg 1441] e 16 nuove tossine Hennekinne et al, EURL review in ESs

8 Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 La distribuzione dei geni che codificano per le ES genoma di S.aureus molto variabile EGC e altri MGEs Batteriofagi SaPIs Plasmidi Trasposoni Caratterizzazione “potenziale tossigenico”

9 Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Protocollo 2 seg, seh, sei, sej, sep Protocollo 1 sea, seb, sec, sed, see, ser Caratterizzazione “potenziale tossigenico”

10 Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Isolamento Estrazione Amplificazione Rivelazione Caratterizzazione “potenziale tossigenico”

11 Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Campionamento Gennaio Dicembre campioni latte e derivati Territorio Piemonte - Torino CPS [ISO :1999/Amd 1:2003] Identificazione Card GP –VITEK; alcuni casi Real Time TaqMan® Staphylococcus aureus Detection Kit [Merker, et al., 2000] Caratterizzazione “potenziale tossigenico”

12 Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Campionamento S. aureus isolato in 180 campioni (22%) di latte e prodotti caseari; 144/645 (22%) e 36/158 (20%). 823 campioni 22% Prodotti 20% Latte 22% Caratterizzazione “potenziale tossigenico”

13 Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Ricerca 11 geni SEs 85 almeno un gene codificante per SEs; distribuzione geni ha permesso di delineare 14 differenti profili genetici. sed-ser-sej (36%) seg-sei (25%) d r j 31 g i 21 a d r j 8 c 8 h 4 a 3 c g i 2 d j 2 a r 1 ghi 1 g i p1 i 1 j 1 r Caratterizzazione “potenziale tossigenico”

14 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs

15 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

16 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) PFGE è una tecnica di caratterizzazione molecolare principio della tecnica: azione degli enzimi di restrizione su un intero genoma frammenti di restrizione (da 10 kb a kb)

17 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) Incorporazione coltura batterica in agarosio Digestione enzimatica smaI Separazione elettroforetica dei frammenti Lettura del gel Anali e interpretazione dei profili CHEF MAPPER Modalità Multi State: (Volts/cm = 6, Included Angle = “+60/-60” Ramping Factor = A “Linear”) Block 1(Blk1) State 1 (St01) [6.0] V/cm a= [linear] Ang = [+ 60] InTm = [5 seconds] FnTm = [15 seconds] Block 1(Blk1) State 2 (St02) [6.0] V/cm a= [linear] Ang = [- 60] InTm = [5 seconds] FnTm = [15 seconds] Migration Time 8 Hours Block 2 (Blk2) State 1 (St01) [6.0] V/cm a= [linear] Ang = [+ 60] InTm = [15 seconds] FnTm = [60 seconds] Block 2 (Blk1) State 2 (St02) [6.0] V/cm a= [linear] Ang = [- 60] InTm = [15 seconds] FnTm = [60 seconds] Migration Time 11 Hours Nel caso si disponga di CHEF DR III impostare lo strumento come segue: Volts/cm = 6, Included Angle = 120 Block 1(Blk1) [6.0] V/cm InTm [5 seconds] FnTm = [15 seconds] Migration Time 8,5 Hours Block 2 (Blk2) InTm = [15 seconds] FnTm = [60 seconds] Migration Time 11,5Hours vs

18 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) Analisi e interpretazione dei profili

19 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) Subtyping Alta discriminazione DNA restriction patterns stabili e riproducibili intra- e inter-laboratorio Indagini epidemiologiche e casi di MTA Vantaggi Alta specializzazione Time-consuming Elevati costi Isolati non tipizzabili (non nel caso di S.aureus) Svantaggi

20 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE)

21 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

22 Staphylococcus aureus Protein A - Typing VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Spa-tipizzazione Sequenza di una porzione VNTR polimorfica nella regione codificante specifica di S.aureus della proteina A stafilococcica. Presenza di molte sequenze ripetute e variabili da ceppo a ceppo ma molto conservate all’interno della specie. Le sequenze ripetute vengono chiamate “sequenze repeat” (circa bp di solito 24)

23 Staphylococcus aureus Protein A - Typing VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Spa-tipizzazione E’ una tecnica di tipizzazione a “singolo locus”, offre una risoluzione di subtyping paragonabile a tecniche più costose e/o laboriose, come MLST e PFGE. Online based – inserimento 4 spatipi nel 2014 Non è un protocollo inserito nel sistema qualità! Pubblicazioni in corso Redazione e distribuzione (2015?)

24 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

25 A differenza di spa-typing MLST è una tecnica di tipizzazione a “locus multiplo”, offre una risoluzione di subtyping più profonda: Geni ulteriori sequenziati: arc (Carbamate kinase) aro (Shikimate dehydrogenase) glp (Glycerol kinase) gmk (Guanylate kinase) pta (Phosphate acetyltransferase) tpi (Triosephosphate isomerase) yqi (Acetyle coenzyme A acetyltransferase) Attività 2015 pianificata ampliamento Multi Locus Sequence Typing (MLST) Ulteriori livelli di tipizzazione

26 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

27 RS-PCR “Genotipi” (Graber et al., Tipizzazione del batteriofago pvl Analisi dei complessi clonali Altri polimorfismi Combinazione molecolare/biotipi zzazione e geni virulenza Ribotyping MALDI-TOF

28 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Whole genome sequencing Ulteriori livelli di tipizzazione “A prerequisite to understanding the complete biology of an organism is the determination of its entire genome sequence” Fleischmann et al Sequenza lineare dell’intero genoma – A T C G- Is the Sequence sufficient to understand biological function of the organisms?

29 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Whole genome sequencing Ulteriori livelli di tipizzazione Recente acquisizione miSeq

30 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

31 Grazie per l’attenzione!


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