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Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite.

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Presentazione sul tema: "Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite."— Transcript della presentazione:

1 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

2 1200 bp SacI EcoRI

3 1.lisi cellulare 2.deproteinizzazione 3.concentrazione Isolamento acidi nucleici

4 Deproteinizzazione: agenti enzimatici solventi organici Precipitazione: cationi + etanolo (Na, NH4) isopropanolo Purificazione acidi nucleici

5

6

7 Protocollo artigianale Colonnine cromatografiche (kit commerciali) Isolamento DNA plasmidico

8 Protocollo artigianale Lisi cellulare con NaOH/SDS Neutralizzazione con Kacetato (precipitazione di proteine) Estrazione fenolo/cloroformio Precipitazione con isopropanolo Risospensione delle cellule in tampone con RNasi Risospensione in TE

9 Spettrofotometro (quantitativa) Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa) Analisi acidi nucleici

10 Spettro di assorbimento del DNA lunghezza donda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD 260 =50 g/ml OD 260 /OD 280 =1,8-2,0

11 Elettroforesi di acidi nucleici Gel di agarosio Gel di acrilammide

12

13 PREPARAZIONE GEL DI AGAROSIO

14 GEL DI AGAROSIO

15 Elettroforesi su gel di agarosio

16 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

17 CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

18

19

20 GEL DI AGAROSIO

21 Migrazione del DNA su gel Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.

22 Fattori che influenzano la migrazione Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi

23 Visualizzazione del DNA

24 Marcatori di peso molecolare HindIII

25 DNA circolare con superavvolgimento = 0 DNA superavvolto negativamente

26

27 B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2007

28 Tecniche di trasferimento su membrana (Blotting) Southern (blot) Northern (blot) Western (blot)

29 Metodi di trasferimento Capillare Elettroblot

30

31 carta 3MM membrana nylon gel supporto } carta 3MM tampone vaschetta Assemblaggio del blot capillare

32

33 Fattori che influenzano libridazione Temperatura Forza ionica pH

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35 ESERCITAZIONI DI BIOLOGIA MOLECOLARE AA 2008/2009 Descrizione generale esercitazioni di laboratorio Analisi del risultato di un clonaggio mediante elettroforesi su gel di agarosio: 1) Preparazione di DNA plasmidico dalle colonie trasformate 2) Analisi del DNA plasmidico su gel di agarosio Preparazione soluzione per la digestione con enzimi di restrizione 3) Digestione DNA plasmidico con enzimi di restrizione Analisi spettrofotometrica del DNA preparato 4) Analisi della digestione su gel di agarosio Discussione dei risultati

36 1200 bp SacI EcoRI


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