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Tecniche ottiche innovative: applicazioni in medicina.

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Presentazione sul tema: "Tecniche ottiche innovative: applicazioni in medicina."— Transcript della presentazione:

1 Tecniche ottiche innovative: applicazioni in medicina

2 Microscopia ottica di (auto)fluorescenza Microscopia confocale Optical tweezers (pinzette ottiche)

3

4 campione

5 Microscopia di (auto)fluorescenza cosè lautofluorescenza microscopia ad autofluorescenza sorgente di eccitazione il campione ottiche di raccolta immagini in autofluorescenza spettro di autofluorescenza vantaggi e svantaggi della tecnica

6 cosè lautofluorescenza Le cellule ed i tessuti biologici contengono molecole che, se eccitate con radiazione di opportuna lunghezza donda, sono fluorogeniche Lautofluorescenza è lemissione di fluorescenza spontanea, dovuta a fluorofori endogeni in cellule e tessuti. L autofluorescenza è così denominata per essere distinta dalla fluorescenza ottenibile con marcatori fluorescenti esogeni (fluorescenza indotta o secondaria).

7 tra i principali fluorofori responsabili dellautofluorescenza vi sono: biomolecole con funzione strutturale (es.: collageno, elastina) biomolecole coinvolte in processi metabolici e funzionali (es.: coenzimi nicotinici, flavine, lipofuscine)

8 immagine di cellula in trasmissione (100x, NA=1.3) h corrispondente immagine in autofluorescenza

9 (auto)fluorescenza: spettri di assorbimento e di emissione

10 La tecnica sorgente per leccitazione ottiche di focalizzazione cella con il campione ottiche di raccolta rivelatore analisi dei dati (Nikon Italia)

11 Schema di principio sorgente Filtro di eccitazione: seleziona la banda di eccitazione I filtro campione rivelatore II filtro Filtro di raccolta: seleziona la banda di emissione e blocca la luce di eccitazione non assorbita dal campione (misura in trasmissione)

12 Problemi della tecnica in trasmissione: - assorbimento della luce di eccitazione da parte del campione - assorbimento dellemissione da parte del campione - diffusione della luce di eccitazione e di emissione da parte del campione - non si ottimizza la raccolta dellemissione, a meno di non avere un condensatore di qualità pari allobiettivo - scarsa praticità (non adatta a microscopi invertiti)

13 tecnica in riflessione - lemissione non attraversa il campione - lobiettivo agisce sia da ottica di focalizzazione che di raccolta - maggior praticità (microscopi invertiti) sorgente campione filtro per leccitazione filtro per lemissione specchio dicroico obiettivo rivelatore

14 dalla sorgente per leccitaz. al rivelatore exc FLUOR

15 210

16 curve di trasmittanza per differenti dicroici 211 T: luce trasmessa (%)

17 sorgente per leccitazione deve avere una buona emissione nella zona UV-blu dello spettro ( nm) deve avere unalta brillanza, costante nel tempo in genere si utilizza una lampada ad arco corto a vapori di mercurio in alternativa: lampada a vapori di Xenon; Xe- Hg; luce laser*

18 spettro di emissione (Osram) - bulbo di quarzo - vapori di Hg ad alta pressione - vita media: ore W lumen Cd/cm 2 - spettro a righe su un fondo continuo alloggiamento (Nikon) per la lampada a vapori di mercurio regione di emissione (arco)

19 204 altre sorgenti lampada a Xenon - ad arco corto, con vapori di Xenon - spettro continuo, poco intenso nellUV-A - più adatta per eccitazione nel visibile (blu) - alta brillanza lampade alogene Scarsa emissione nelle bande UV. Brillanza inferiore alle lampade ad arco corto. lampada a Xe-Hg Allo spettro dello Xenon somma quello del mercurio.

20 il campione cellule in condizioni vitali fettine sottili di tessuto (cellule fissate) ATTENZIONE A: presenza di sostanze fluorescenti nel terreno di coltura => lavare le cellule ! cellule morte: rilasciano fluorofori (endogeni) nel mezzo => aumenta il fondo ! usare vetrini (ed ottiche) non fluorescenti

21 spessore della cella di misura: paragonabile alle dimensioni di una cellula segnale: può provenire in parte dal tampone ob. porta oggetti copri oggetti c1 c2 c1,c2: cellule adese sul fondo

22 emissione di autofluorescenza INFO: metaboliche funzionali INFO: strutturali morfologiche spettro della luce emessa immagine della luce emessa

23 acquisizione sia dello spettro che dellimmagine di autofluorescenza spettrometro CCD per imaging di autofluorescenza avrò bisogno di: MIAM (Multispectral Intensity Autofluorescence Microscopy)

24 SPECTRUM ANALYSER COOLED CCD CAMERA un possibile setup sperimentale

25 immagini come si acquisiscono cenni ai sensori CCD come accoppiare obiettivo e telecamera risoluzione spaziale

26 CCD: array di elementi fotosensibili, lineari o bidimensionali (es.: 512x512; 1024x1024, dimensione elemento tipica 10 m x 10 m) I fotoni incidenti sulle zone sensibili generano elettroni (fotoelettroni) che vengono accumulati in regioni dette pixel I fotoelettroni vengono intrappolati nei pixels da un campo elettrico locale La presenza di elettrodi permette di spostare i fotoelettroni sul CCD lintensità del pixel è proporzionale al numero di fotoelettroni prodotti, ovvero allenergia rilasciata dalla luce incidente Charge Coupled Device (CCD)

27 Immagine in bianco e nero. Il livello di grigio di ogni punto è proporzionale allintensità luminosa che arriva. emissione di autofluorescenza CCD B/N in alternativa: CCD colori immagine a colori Soluzione meno adatta. Spesso non ha la sensibilità e risoluzione spaziale di una CCD B/N.

28 Immagine B/N. Intensità dei punti proporzionale allintensità di luce ROSSA incidente F1 Immagine B/N. Intensità dei punti proporzionale allintensità di luce VERDE incidente F2 Immagine B/N. Intensità dei punti proporzionale allintensità di luce BLU incidente F3 + + immagine RGB finale (ad ogni immagine sostituisco i livelli di grigio con livelli di Rosso, Verde, Blu rispett.) = CCD filtro passa banda emissione di autofluorescenza revolver con i 3 filtri

29 BLU VERDE ROSSO 3 acquisizioni distinte, in successione temporale immagine finale ricombinazione di immagine (es.: 3 layer con Photoshop® ) problemi derivanti dal movimento del campione e dal bleaching

30 CCD ruota porta-filtri filtri a banda larga centrati su: R: ~650nm G: ~550nm B: ~450nm

31 come accoppiare la CCD allobiettivo

32 Il flusso di eccitazione focalizzato sul campione è proporzionale a (NA obj ) 2

33 Lintensità di fluorescenza emessa è proporzionale al flusso di eccitazione (se questo non è così elevato da produrre quenching) EPI-FLUORESCENZA (epi- : raccolgo dalla stessa parte da cui eccito)

34 La frazione di autofluorescenza emessa che viene recuperata dallobiettivo è proporzionale a (NA obj ) 2

35 Se lingrandimento totale sul rivelatore (fotocamera) è M, verrà proiettata unimmagine di una superficie M 2 volte più grande, Ovvero Lintensità che arriva su ogni pixel (I) è proporzionale a 1/ M 2 RIASSUMENDO I (NA obj ) 4 / M 2

36 RISOLUZIONE SPAZIALE Criterio di Raileigh E la minima interdistanza r tra 2 punti sorgente visti come distinti: r( m) = 0.61 / NA obj = 550nm, NA =1.4r = 0.24 m La risoluzione cresce proporzionalmente a NA r piccolo => grande risoluzione

37

38 Per ottimizzare la risoluzione del sistema microscopio-CCD La larghezza W del pixel deve essere tale che W (r M)/2 = 0.61 M / 2NA obj W r M Ovvero M 2W/r = 2 W NAobj / (0.61 )

39 ESEMPIO Pixel 9x9 m ; = 550nm; NA =1.4 M 2W/r = 2 W NA obj / (0.61 ) M 18/r = 18/0.24 = 75 x Volendo incrementare la risoluzione dobbiamo far sì che la distanza tra 2 punti sia almeno di 3 pixel e quindi aumentare M M 3W/r =27/0.24 =113x (Tra 75x e 113x la risoluzione non cambia….) M non dipende solo dallobiettivo. Per es. nei microscopi Nikon cè unulteriore ingrandimento 2x o 1.5x sulla porta della fotocamera

40 Ricordando che I (NA obj ) 4 / M 2 è necessario un compromesso tra intensità del segnale e risoluzione (ingrandimento) Fissata NA obj, I alta => M basso => fissata la dimensione dei pixel, con M basso posso non arrivare a sfruttare la risoluzione dellobiettivo M alto => I bassa: fissata NA obj, con M alto posso avere unintensità troppo bassa => basso rapporto segnale-rumore

41 risoluzione spaziale del sistema CCD - obiettivo Ci si dovrebbe sempre riferire alla risoluzione spaziale dellintero sistema CCD - obiettivo Viene a volte definita per la sola CCD, come numero di pixel totali o come dimensioni dellelemento sensibile: non e una vera risoluzione! dipende dalla risoluzione spaziale dellobiettivo e dalle caratteristiche della camera la camera deve essere commisurata allobiettivo in uso: e inutile usare una camera da 5Mpixel con un obiettivo a bassa apertura numerica (es.: N.A.=0.4). Otterro la stessa risoluzione spaziale complessiva usando per es. una camera da 2Mpixel!

42 Risposta spettrale Indica la sensibilita alla luce di una data. Il dato viene presentato come efficienza quantica (Quantum Efficiency) o come risposta (Responsivity o Sensitivity) in funzione di. Serve a scegliere la camera capace di rispondere alla banda spettrale della radiazione considerata. Tutti i CCD al silicio hanno una risposta soddisfacente nel visibile e fino a 1000nm circa.

43 Esempio sensore 512x512 pixel o superiore con pochi difetti costruttivi dimensione del pixel: 5-10 m raffreddata (fino a -30 o C) tempo di integrazione di immagine: da 1ms a >30s; tempi tipici: 1-4s tempo di svuotamento del sensore (lettura immagine): 2-4s In pratica: se non si vogliono vedere fenomeni veloci (t<<1s) è indicata una CCD più sensibile ma più lenta.

44 Gli elementi ottici del microscopio (flitri dicroici, lenti, filtri interferenziali etc. ) riducono la luce Efficienza di raccolta max 10% Efficienza media delle camere CCD (front illuminated ) circa 40% nel blu circa 20 % (back illuminated) circa 70% nel blu circa 40 % EFFICIENZA TOTALE 4%

45 Rumore nelle CCD Rumore quantistico: Photon noise (shot noise). Dovuto alla variazione statistica del numero di fotoni incidenti e portatori di carica prodotti (N). SNR = N/N = N migliora al crescere di N. Es.: fotoni/(s pixel) Rumore termico: dark noise (dark current). Dovuto alla generazione di portatori di carica termici. Cresce con la temperatura T. Es.: elettroni/(s pixel) Rumore elettronico: read noise. E relativo ai processi di conversione della carica prodotta in segnale digitale. Non dipende dal tempo di esposizione. Dipende poco da T; piu importante a bassi livelli di segnale. Es.: elettroni rms/pixel Rumore: lo scarto quadratico medio della variazione del segnale catturato da un pixel

46 Rumore totale sul segnale: Segnale massimo (saturazione) Rumore Dinamica = Dinamica usualmente espressa in bit di risoluzione: es. dinamica di 16 bit

47 binning E laccorpamento di piu pixel in un unico pixel risultante. Es.: 600x1000 pixels =>200x125 pixels con binning 3x8 accresce il rapporto S/N, la sensibilita, la velocita di acquisizione diminuisce la risoluzione spaziale; accresce la corrente di buio Usato spesso in modalita di preview, o per avere immagini sufficientemente intense con alto frame rate (« il segnale che perdo andando veloce, lo recupero con il binning, perdendo pero in risoluzione spaziale »)

48 per diminuire il rumore Rumore quantistico: si accresce il numerodi fotoelettroni prodotti (se si puo…) (i) eccitazione piu intensa (ii) tempi di integrazione maggiori (iii) binning (iv) CCD con efficienza quantica piu alta Dark noise: si raffredda il sensore CCD (tipicamente T= o C, fino a T di N 2 liquido) Read noise: filtri elettronici. Sensore con elettronica migliore.

49 rapporto segnale-rumore: ~ 2 segnale: media dei valori dei pixel della cellula rumore: media dei valori dei pixel del fondo 1.Aumentare il tempo di integrazione. Aumentare lintensità di eccitazione. (pero: rischio di bleaching e danno cellulare !) 2.Raffreddare maggiormente la CCD 3.Verificare la corretta centratura dellilluminazione UV 4.Lavare ulteriormente le cellule (con tampone non fluorescente)

50 spettro di autofluorescenza cosè come si acquisisce un esempio

51 lemissione di autofluorescenza raccolta dallobiettivo viene inviata ad uno spettrometro (es. attraverso una fibra ottica) lo spettrometro la separa nei vari colori; il fascio così suddiviso incide su una telecamera CCD, di larghezza pari alle dimensioni trasversali del fascio. lintensità luminosa, per ogni lunghezza donda, viene così trasformata in segnale (livello di grigio del pixel corrispondente) immagine di un fascio con spettro fatto di righe (illuminazione al neon del laboratorio)

52 alloggiamento per la fibra ottica mazzo di fibre (bandolo) raccordo fibra-microscopio CCD per lacquisizione dello spettro policromatore (spettrometro) arrivo della fibra e fenditura di ingresso al policromatore

53 dimensione maggiore della CCD: asse della lunghezza donda dimensione trasversale del fascio sulla CCD (=dimensione maggiore della fenditura) spettro = istogramma dei conteggi della CCD N.conteggi( ) intensità luminosa ( ) numero di conteggi

54 spettro grezzo spettro corretto

55

56 vantaggi su altre tecniche non richiede particolare preparazione del campione scarsamente invasiva (assenza di fluorofori esogeni) campioni in condizioni vitali intensità di eccitazione contenuta MIAM: info sia morfologiche che funzionali

57 svantaggi il segnale è basso => CCD sensibili, a basso rumore uso di ottiche con bassissima emissione di fluorescenza non tutti i compartimenti cellulari sono autofluorescenti (es. nucleo) minor selettività rispetto alla fluorescenza per lo studio di specifiche strutture cellulari la massima utilità e su campioni vivi (ex-vivo)

58 conclusioni emissione di autofluorescenza misura del segnale di autofluorescenza: - sorgente di eccitazione - campione ed emissione - raccolta di luce analisi dellemissione: - immagini - spettro

59 microscopia confocale Microscopio confocale · luce laser incide su un punto del campione alla volta · la luce che proviene dai punti non a fuoco viene bloccata dal diaframma B · per vedere un punto del campione, bisogna che siano a fuoco contemporaneamente la luce incidente sul punto e quella riflessa, che deve poter passare per il foro del diaframma B; in questo modo i punti non a fuoco non danno effetti indesiderati di luminosità ambientale · la tecnica richiede la scansione punto per punto della zona di interesse del campione credit: UniTOrino, Dip. Biologia Vegetale

60 MICROSCOPIA CONFOCALE

61 1) microscopia ottica convenzionale non solo il piano di fuoco dell'obbiettivo, ma anche gran parte dello spessore dell'oggetto biologico sono uniformemente e simultaneamente illuminati => le aree sopra e sotto il piano focale di interesse rendono meno distinguibili le strutture cellulari. …cominciamo con un confronto:

62 campione

63 2) microscopia confocale - la luce emessa da regioni fuori del piano di fuoco dell'obbiettivo viene eliminata - l'illuminazione non e' simultanea, ma sequenziale, concentrata come un punto su un singolo elemento del volume del campione alla volta - per formare l'immagine, il raggio luminoso di illuminazione esplora il campione secondo uno schema raster -sorgente laser: monocromatica, molto sottile e poco penetrante la luce riflessa o la fluorescenza emessa vengono rilevate da un tubo fotomoltiplicatore e convertite in segnale digitale (=> monitor) - principio di Minsky: i sistemi di illuminazione e di rivelazione sono focalizzati sul medesimo elemento del volume dell'oggetto biologico, ovvero sono confocali - un filtro spaziale (pinhole), messo davanti al rivelatore, elimina la luce emessa dalle regioni fuori del piano di fuoco dell'obbiettivo => immagine piu dettagliata, perche' vengono eliminate le informazioni fuori fuoco.

64 Credit: Luca Verderame (liceo ISSEL, Finale Ligure) Giacomo Carrabino (liceo A. Pacinotti, La Spezia) Gabriele Marino (liceo Grassi, Savona)

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66 Microscopia ottica convenzionale Microscopia confocale in riflessionein trasmissione

67 vantaggi svantaggi Maggiore risoluzione spaziale Maggior contrasto miglior sezionamento ottico => migliore qualità ricostruzioni 3D campioni sezionabili in vari piani spaziali, non solo x-y disponibilità di ottime soluzioni commerciali ma anche fai da te peggiore risoluzione temporale* maggiore invasività (in alcuni casi) maggior costo * vedi pero sistemi a molti punti

68 pinzette ottiche (optical tweezers)

69 Tecnica che utilizza luce fortemente focalizzata per esercitare forze di intrappolamento stabile su oggetti microscopici, in genere presenti allinterno di una soluzione acquosa luce laser ( t.c. bassissimo assorbimento da parte del mezzo e delloggetto) obiettivi ad alta apertura numerica campione tale che n mezzo

70 Schema di principio Intrappolamento di una sfera dielettrica: regime di ottica geometrica. Cessione di momento dallonda alloggetto. perché funziona regime di ottica geometrica regime di ottica fisica

71 Intrappolamento: piano orizzontale. W 0 : semi-larghezza del fascio laser Intrappolamento verticale regime di ottica fisica si distinguono 2 tipi di forze: F g =forza di gradiente F s =forza di scattering

72 1.La forza del tweezer aumenta proporzionalmente alla potenza del fascio laser 2.per ottenere trappole forti è necessario usare fasci con grandi angoli di convergenza (fino a 70gradi), altrimenti assialmente la forza di scattering domina su quella di gradiente 3.per ottenere grandi angoli di convergenza è necessario usare un obbiettivo ad alta apertura numerica (fino a 1.4) e presentare in ingresso a questo un fascio di dimensioni maggiori o uguali al suo diaframma di ingresso 4.il tweezer è più forte radialmente che assialmente 5.la stabilità del tweezer può essere quantificata dal rapporto tra la profondità U della buca e k B T. Si può definire stabile una trappola in cui è maggiore di un valore di soglia (per es. 50 o 100) oltre il quale gli effetti di moto termico possono essere considerati trascurabili e la particella pensata come ferma 6.se lindice di rifrazione della particella è inferiore a quello del mezzo in cui è immersa (es. una bolla daria in acqua), il tweezer non è stabile poiché la forza di gradiente cambia verso. Leffetto è repulsivo.

73 Esempio di setup per una pinzetta ottica accoppiata ad un microscopio

74 pinzette multiple è possibile commutare la posizione di focalizzazione del laser fra 2 o piu punti del campione dovro usare per es. un Modulatore Acusto- Ottico frequenza di commutazione: es: 1KHz (mi devo confrontare con il moto diffusivo delloggetto) ultima frontiera: pinzette multiple (N>1000) sfruttando effetti diffrattivi di speciali chip

75 applicazioni chromosome surgery / genetica studi su mitosi e motilità cellulare studi sulla membrana cellulare / fusione cellulare fertilizzazione in vitro scalpello laser principi del funzionamento muscolare protein folding biofisica di singola molecola / cellulare

76 applicabile ex vivo, in vitro permette di manipolare la singola cellula / batterio / molecola utilizzabile insieme a numerose altre tecniche di microscopia campione immerso in un mezzo liquido (es.: soluzione tampone) scarsa preparazione del campione possibilità di misure di forza / lunghezza (=> parametri elastici) di tipo puntuale bassi costi (se basta che funzioni) non applicabile in vivo non applicabile a secco difficilmente applicabile ad un sistema con N »1 elementi (pur se microscopico) difficilmente applicabile ad oggetti di dimensioni » µm alti costi (se si vogliono grandi forze, basso rumore, alta risoluzione spazio-temporale) ancora non (sufficientemente) disponibile come kit all included in commercio non facilmente trasportabile da un luogo allaltro PRO CONTRO


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