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Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica.

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Presentazione sul tema: "Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica."— Transcript della presentazione:

1 Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica

2 Il microscopio ottico ed elettronico (T.E.M) OCULARE OBBIETTIVI TAVOLINO PORTA CAMPIONE CONDENSATORE DIAFRAMMA DI CAMPO LAMPADA CANNONE ELETTRONICO PORTA CAMPIONE CONDENSATORE OBBIETTIVO SCHERMO FLUORESCENTE CAMERA FOTOGRAFICA

3 1 mm 100 µm 10 µm 1 µm 100 nm 10 nm 1 nm 1 Å Occhio umano Microscopio ottico Microscopio elettronico a trasmissione Microscopio elettronico a scansione LARISOLUZIONELARISOLUZIONE LARISOLUZIONELARISOLUZIONE Aumentando la risoluzione aumentano proporzionalmente anche gli artefatti e la loro visibilità

4 la luce del microscopio ed il fascio di elettroni possono attraversare solo materiale di spessore molto ridotto il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi ed utramicrotomi la maggioranza dei tessuti biologici sono molli prima del taglio, il tessuto deve essere indurito –Fissazione –Inclusione –Congelamento i tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrasto prima dellosservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato o contrastato coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica Problematiche…

5 Fasi della preparazione Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione

6 Prelievo Il prelievo è loperazione fisica con la quale si ottiene il campione da esaminare Deve essere eseguito da materiale biologico vivente Riduzione 10x10x3 mm per la microscopia ottica Spessore 2 mm per la microscopia elettronica Deve essere eseguito il più velocemente possibile

7 Fasi della preparazione Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione

8 La Fissazione Ha lo scopo di bloccare i processi di degenerazione del tessuto prelevato rendendolo stabile nel tempo ed inalterabile allazione dei successivi trattamenti Mantiene inalterate le caratteristiche strutturali del campione, preservandone la morfologia Protegge il campione da danni osmotici (swelling e shrinking) FISICA CHIMICA Congelamento in N 2 o -30°C Calore (fiamma viva per materiale biologico strisciato su vetrino Esposizione del tessuto a T molto alte o molto basse: Uso di sostanze chimiche: Perfusione Immersione Con vapori

9 La fissazione chimica LE ALDEIDI FORMALDEIDE usata in soluzione (4-10%) in tampone pH 7.4 elevato potere di penetrazione ( 0.8 mm/h) agisce formando legami crociati con gli aa delle proteine (reversibili) preserva una buona morfologia PARAFORMALDEIDE preserva la reattività delle macromolecole indicata per indagini biochimiche Formaldeide 4-10% + Saccarosio 2% in PBS pH ore 4°C Microscopia Ottica PFA 10% + Saccarosio 2% in PBS pH ore 4°C

10 GLUTARALDEIDE penetra bene nei tessuti, ma meno rapidamente della formaldeide forma cross-legami più velocemente e più stabilmente della formaldeide non fissa i lipidi, quindi per preservare le membrane La fissazione chimica LE ALDEIDI Microscopia Elettronica GA 2-4% in Tampone Fosfato pH ore 4°C Post-fissazione con Osmio Tetrossido Fissa i lipidi insaturi agisce rapidamene, ma penetra molto poco Fissativo 2° reagisce in modo differente con i vari componenti cellulari accentuando le differenze di densità e fornendo una sorta di colorazione OsO 4 1-2% In Tampone Fosfato pH ore 4°C buio

11 I Tamponi I fissativi devono essere diluiti in tamponi a pH in modo che non ci sia diversità di pH fra il tessuto e la soluzione fissativa e per evitare artefatti dovuti a differenze di osmolarità Gli stessi tamponi utilizzati per diluire i fissativi devono essere impiegati per effettuare i lavaggi che seguono la fissazione (1-2 ore) PBS Tampone fosfato di Sorensen Tampone Cacodilato Fosfato bisodico 0.2M + Fosfato monosodico 0.2M Cacodilato di Na 0.24M + HCl 0.2M Più stabile nel tempo, ma contiene arsenico che è tossico

12 Fasi della preparazione Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione

13 La Disidratazione E il passaggio che permette la sostituzione dellacqua contenuta nel tessuto con un solvente dei mezzi di inclusione (Paraffina o resine) La disidratazione si effettua mediane passaggi del campione in soluzioni di alcool in una scala crescente di concentrazioni Alcool 70% Alcool 90% Alcool 100% Fissazione 3° con Acetato di Uranile in alcool 70% (T.E.M.) Chiarificazione Lultimo agente deve essere miscibile con i mezzi di inclusione Xilolo Acetone assoluto Ossido di propilene Paraffina Resine idrofobiche per T.E.M. Infiltrazione Dopo aver concluso la disidratazione del campione bisogna sostituire gradualmente lo xilolo o lacetone con il mezzo di inclusione in forma liquida ( Xilolo/acetone:mezzo di inclusione ) 3:12:11.1 1:2 1:3

14 Fasi della preparazione Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione

15 Inclusione E il passaggio che permette di impregnare il campione in un materiale abbastanza duro ed omogeneo tale da poter essere tagliato in fette molto sottili PARAFFINA (M.O.) RESINE (T.E.M.) Miscela di idrocarburi saturi solida a T ambiente punto di fusione a 54-60° insolubile in H 2 O, solubile in xilolo Epon, Araldite liquida a T ambiente polimerizza a 60-70°C insolubile in H 2 O, solubile in acetone si preparano a partire da soluzioni di monomeri, da sostanze plasticizzanti che migliorano la consistenza finale del polimero e da un acceleratore chimico per la reazione di polimerizzazione Il campione viene immerso in paraffina o resina pura per completarne linfiltrazione

16 T ambiente 4°C Polimerizzazione Paraffina (m.o.) Resina (T.E.M) 60-70°C Blocchetti pronti per essere tagliati in sezioni

17 Il taglio delle sezioni MICROTOMO Strumento che permette di sezionare i blocchetti di paraffina contenenti il campione in fette spesse 3-10 uM

18 La raccolta delle sezioni La colorazione I coloranti sono di solito in soluzione acquosa Le sezioni devono essere sparaffinate in xilolo e reidratate con scala decrescente di alcool (100, 90, 80, 70, 50,H 2 O) Metodica ematossilina eosina Ematossilina 10 min Lavaggio con H 2 O corrente Eosina 1 min Disidratazione Montaggio Vetrini Xilanizzati

19 Ematossilina: nuclei Eosina: citoplasma ematossilina eosina

20 COLORANTI PER MICROSCOPIA OTTICA I tessuti assumono i coloranti in base alle caratteristiche delle strutture che li compongono ACIDI ACIDI carica negativa formano sali con basi colorano citoplasma BASICI BASICI carica positiva formano sali con acidi colorano i nuclei NEUTRI NEUTRI formati dallunione di un colorante acido con uno basico NATURALI animali : es. carminio (colorante acido nucleare) vegetali: es. ematossilina (colorante acido)ARTIFICIALI eosina (colorante basico citoplasmatico) fucsina, violetto di genziana (coloranti nucleari)

21 COLORAZIONI chimiche chimiche: reazione tra colorante e substrato evidenziano molecole come lipidi e zuccheri COLORAZIONI ISTOCHIMICHE OLIO ROSSO O O.R.O (PER LIPIDI) o.r.o. sciolto in soluzione di alcool etilico ed etere alcool etilico ed etere estraggono dalle cellule i lipidi o.r.o si deposita al loro posto P.A.S. (PER ZUCCHERI) acido periodico di schiff ossida i gruppi CHOH-CHOH degli zuccheri CHOH-CHOH reagisce con composto fucsina-acido solforoso e da colorazione fucsia CHO-CHO chimiche fisiche chimico fisiche

22 FISICHE FISICHE: precipitazione di metalli su strutture biologiche CHIMICO-FISICHE CHIMICO-FISICHE : meccanismo di assorbimento elettrico substrato e colorante hanno cariche diverse e formano sali fra loro EMATOSSILINA EOSINA Es. impregnazione argenticaSali dargento + sostanza riducente liberazione di Ag metallico che si deposita sulle strutture biologiche argentofile (fibre nervose)

23 ULTRAMICROTOMO Strumento usato per sezionare i blocchetti di resina in sezioni molto sottili SEMIFINI: sezioni di 1 uM di spessore, la cui osservazione al m.o. permette di selezionare i campi utili destinati ellesame ultrastrutturale al T.E.M.

24 SEZIONI ULTRAFINI: sezioni di nm di spessore Lama di diamante Il taglio delle sezioni Raccolta delle sezioni retino

25 LA COLORAZIONE il contrasto dipende dal numero atomico degli atomi del campione piu e alto il numero atomico, piu elettroni sono dispersi, maggiore e il contrasto le molecole biologiche sono costituite da atomi con numero atomico basso (H, C, O) le sezioni vengono contrastate con sali di metalli pesanti Acetato di Uranile e Citrato di Piombo

26 …un esempio di applicazione semifini UVB 1 MEDUVB 10 MED fini


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