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Metodi di studio. Il primo microscopio ottico Un microscopio semplice Hooke, 1665.

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Presentazione sul tema: "Metodi di studio. Il primo microscopio ottico Un microscopio semplice Hooke, 1665."— Transcript della presentazione:

1 Metodi di studio

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3 Il primo microscopio ottico Un microscopio semplice Hooke, 1665

4 Un moderno microscopio

5 Microscopi ottici da esercitazione

6 Anatomia di un microscopio Stativo Fonte di illuminazione Fotocamera o telecamera Oculari Diaframma di campo Revolver con obiettivi Tavolino traslatore Vite macrometrica e micrometrica Condensatore

7 Anatomia di un microscopio

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10 Microscopia Ottica

11 OSSERVAZIONI A FRESCO Microscopia Ottica Prime osservazioni Prime osservazioni Il preparato si deteriora velocemente Poco informative Poco informative Descrizioni brevi ed inesatte Prime osservazioni Prime osservazioni Il preparato si deteriora velocemente Poco informative Poco informative Descrizioni brevi ed inesatte

12 Preparati in campo chiaro a goccia schiacciata Su un vetrino porta-oggetto si pone una goccia di acqua o soluzione fisiologica Il materiale da osservare viene posto sulla goccia ed osservato

13 Preparati in campo chiaro Un batterio Campo chiaro, 1000x Cellul e

14 Microscopia Ottica a Contrasto di fase campo chiaropoco contrastoGli oggetti visti in campo chiaro hanno poco contrasto sfruttare le lievi differenze di indice di rifrazionePer migliorare le immagini è possibile sfruttare le lievi differenze di indice di rifrazione del materiale da osservare rispetto al mezzo circostante Applicando nel condensatore delle variazioni di fase alla luce che raggiunge il preparato e applicando variazioni opposte nellobiettivo I raggi luminosi che sono stati modificati generano fenomeni di interferenza che rendono più chiari o più scuri gli oggetti illuminati campo chiaropoco contrastoGli oggetti visti in campo chiaro hanno poco contrasto sfruttare le lievi differenze di indice di rifrazionePer migliorare le immagini è possibile sfruttare le lievi differenze di indice di rifrazione del materiale da osservare rispetto al mezzo circostante Applicando nel condensatore delle variazioni di fase alla luce che raggiunge il preparato e applicando variazioni opposte nellobiettivo I raggi luminosi che sono stati modificati generano fenomeni di interferenza che rendono più chiari o più scuri gli oggetti illuminati

15 Microscopia Ottica a Contrasto di fase Permette, tramite sistema di lenti di osservare le cellule a fresco Le varie parti della cellula appaiono come strutture con diverse tonalità di grigio

16 Un batterio 400x Un lievito (S. cerevisiae) 400x Una muffa (G. candidum) 400x

17 Osservazione in campo scuro Un particolare tipo di condensatore nellosservazione in campo scuro consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dellobiettivo siano attraversati soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi dal preparato. Gli oggetti appariranno chiari su uno sfondo scuro. In questo modo è possibile osservare oggetti anche al di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico

18 Osservazione in campo scuro

19 Uso di colorazioni per migliorare il contrasto dei preparati Utilizzando diverse classi di coloranti è possibile migliorare il contrasto delle immagini al microscopio Coloranti vitali Le cellule possono essere colorate senza fissazione e sono quindi solo minimamente alterate dal trattamento Oggi vengono utilizzati coloranti fluorescenti per colorare selettivamente specie diverse o strutture cellulari diverse Coloranti che richiedono fissazione Le cellule devono essere disidratate prima della colorazione, con possibile alterazione delle strutture cellulari e della forma delle cellule

20 Preparazione di un Campione Biologico per la Microscopia Ottica Acquisizione Acquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm 3 ) Biopsia, intervento chirurgico, autospia postmortem Prelevato rapidamente utilizzando strumenti adatti (bisturi) Acquisizione Acquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm 3 ) Biopsia, intervento chirurgico, autospia postmortem Prelevato rapidamente utilizzando strumenti adatti (bisturi)

21 Fissaggio Fissaggio del campione (immobilizzare, "uccidere" e preservare) Generalmente per mezzo di aldeidi reattive (formaldeide) Cross-link delle macromolecole, in particolare le proteine Si ottiene un effetto indurente sui tessuti "molli" Deve essere fatto rapidamente per evitare che gli enzimi persenti degradino il tessuto Fissaggio Fissaggio del campione (immobilizzare, "uccidere" e preservare) Generalmente per mezzo di aldeidi reattive (formaldeide) Cross-link delle macromolecole, in particolare le proteine Si ottiene un effetto indurente sui tessuti "molli" Deve essere fatto rapidamente per evitare che gli enzimi persenti degradino il tessuto

22 Disidratazione Disidratazione del campione attraverso passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo Paraffina Paraffina (materiale usato per l'inclusione) non è solubile in H 2 O Eliminazione Eliminazione dell'etanolo e passaggi in xilene Paraffina non è solubile nemmeno nell'etanolo Disidratazione Disidratazione del campione attraverso passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo Paraffina Paraffina (materiale usato per l'inclusione) non è solubile in H 2 O Eliminazione Eliminazione dell'etanolo e passaggi in xilene Paraffina non è solubile nemmeno nell'etanolo

23 Inclusione Inclusione del campione in in mezzo appropriato paraffina o resina Tessuti sono "molli" e fragili Diversi passaggi in paraffina calda La paraffina occupa lo spazio precedentemente occupato dall'H 2 O La paraffina fredda si indurisce e permette di sezionare il campione Inclusione Inclusione del campione in in mezzo appropriato paraffina o resina Tessuti sono "molli" e fragili Diversi passaggi in paraffina calda La paraffina occupa lo spazio precedentemente occupato dall'H 2 O La paraffina fredda si indurisce e permette di sezionare il campione

24 Sezione non colorata Taglio Taglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10 m Montaggio Montaggio delle sezioni su vetrini per microscopia Taglio Taglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10 m Montaggio Montaggio delle sezioni su vetrini per microscopia

25 Colorazione Colorazione delle sezioni con il metodo più appropriato I coloranti sono a base acquosa, per cui si elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo Colorazione Colorazione delle sezioni con il metodo più appropriato I coloranti sono a base acquosa, per cui si elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo Colorazione automatizzata

26 Colorazioni Colorazione Colorazione Con un colore brillante di certe componenti del tessuto Contro colorazione Contro colorazione Del resto del tessuto con un colore contrastante Colorazione Colorazione Con un colore brillante di certe componenti del tessuto Contro colorazione Contro colorazione Del resto del tessuto con un colore contrastante

27 Ematossilina Ematossilina Ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine) Eosina Eosina Ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol) Ematossilina Ematossilina Ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine) Eosina Eosina Ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol) Ematossilina/Eosina

28 Perchè questa "slide" è blu … Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di blu/porpora, viene detta basofila Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di blu/porpora, viene detta basofila È colorata dall' ematossilina È colorata dall' ematossilina Nuclei e ribosomi generalmente sono basofili Nuclei e ribosomi generalmente sono basofili Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di blu/porpora, viene detta basofila Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di blu/porpora, viene detta basofila È colorata dall' ematossilina È colorata dall' ematossilina Nuclei e ribosomi generalmente sono basofili Nuclei e ribosomi generalmente sono basofili

29 … e questa rossa ? rosso /arancio/rosa acidofila o eosinofila Se una porzione si colora in rosso /arancio/rosa, viene detta acidofila o eosinofila eosina È colorata dall' eosina proteine del citosol Sono le proteine del citosol rosso /arancio/rosa acidofila o eosinofila Se una porzione si colora in rosso /arancio/rosa, viene detta acidofila o eosinofila eosina È colorata dall' eosina proteine del citosol Sono le proteine del citosol

30 Altre colorazioni PAS (Acido Periodico-Reattivo di Schiff) PAS (Acido Periodico-Reattivo di Schiff) Per sostanze ricche in zuccheri (muco) Tricromica o Hazan- Mallory Tricromica o Hazan- Mallory Per i tessuti connettivi Le fibre si colorano in blu Con E&E sono rosa PAS (Acido Periodico-Reattivo di Schiff) PAS (Acido Periodico-Reattivo di Schiff) Per sostanze ricche in zuccheri (muco) Tricromica o Hazan- Mallory Tricromica o Hazan- Mallory Per i tessuti connettivi Le fibre si colorano in blu Con E&E sono rosa Le aree bianche sono lipidi Adiposo Bianco

31 Osmio o Sudan black Osmio o Sudan black Per grasso/lipidi/mielina I lipidi non incorporano coloranti acquosi Argento ed oro Argento ed oro Per fibre delicate e processi cellulari Giemsa Giemsa Per le cellule del sangue Simile ad E&E Osmio o Sudan black Osmio o Sudan black Per grasso/lipidi/mielina I lipidi non incorporano coloranti acquosi Argento ed oro Argento ed oro Per fibre delicate e processi cellulari Giemsa Giemsa Per le cellule del sangue Simile ad E&E Mielina Cellule nervose Cellule del sangue

32 E le aree "bianche"? I fluidi presenti nei tessuti o negli spazi interstiziali non si colorano con E&E Sangue, linfa etc. Si riconoscono come ampi spazi bianchi Anche i lipidi ed il grasso non si colorano I fluidi presenti nei tessuti o negli spazi interstiziali non si colorano con E&E Sangue, linfa etc. Si riconoscono come ampi spazi bianchi Anche i lipidi ed il grasso non si colorano Mesenchima

33 Interpretate il campione !!! 3 dimensioni Dovete pensare in 3 dimensioni Sezioni seriali Sezioni seriali sono l'ideale per l'interpretazione e la ricostruzione 3 dimensioni Dovete pensare in 3 dimensioni Sezioni seriali Sezioni seriali sono l'ideale per l'interpretazione e la ricostruzione

34 Ricostruzione per mezzo di sezioni seriali

35 Artefatti Shrinkage Shrinkage Lascia dello spazio aggiuntivo Disidratazione e fissaggio Fratture al piano di taglio Fratture al piano di taglio Tagli netti e ben visibili Lama deteriorata Shrinkage Shrinkage Lascia dello spazio aggiuntivo Disidratazione e fissaggio Fratture al piano di taglio Fratture al piano di taglio Tagli netti e ben visibili Lama deteriorata

36 Colorante precipitato Colorante precipitato Macchie di colore a "grano di pepe Tessuto "pinzato" Tessuto "pinzato" Strumento per l'excisione deteriorato Durante o dopo il sezionamento Pieghe Pieghe Durante il montaggio Colorante precipitato Colorante precipitato Macchie di colore a "grano di pepe Tessuto "pinzato" Tessuto "pinzato" Strumento per l'excisione deteriorato Durante o dopo il sezionamento Pieghe Pieghe Durante il montaggio

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38 Microscopia Elettronica

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40 Microscopia Elettronica a Trasmissione Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta Alta risoluzione Alta risoluzione Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi Gli elettroni passano attraverso il campione Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta Alta risoluzione Alta risoluzione Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi Gli elettroni passano attraverso il campione

41 La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio ottico Risoluzione dell'occhio Risoluzione dell'occhio: 0.2 mm = 200 µm Risoluzione del MO Risoluzione del MO: 200 nm = 2,000 Angstroms Risoluzione del TEM: 2 Angstroms 1 mm = 1000 µm 1 µm = 1000 nm 1 nm = 10 Angstroms Pinocitos i

42 Preparazione di Campioni Biologici per TEM Acquisizione Acquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm 3 ) Fissaggio Fissaggio del campione con glutaraldeide e poi tetrossido di osmio Losmio è un metallo pesante che si lega ai lipidi, rendendoli elettrondensi (neri) Coloranti non legano i lipidi, che nelle sezioni appaiono chiari Acquisizione Acquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm 3 ) Fissaggio Fissaggio del campione con glutaraldeide e poi tetrossido di osmio Losmio è un metallo pesante che si lega ai lipidi, rendendoli elettrondensi (neri) Coloranti non legano i lipidi, che nelle sezioni appaiono chiari

43 Disidratazione Disidratazione dei campioni tramite passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo Inclusione Inclusione dei campioni in piccoli blocchi di resina Taglioultra- microtomo Taglio dei campioni inclusi con un ultra- microtomo dotato di lama al diamante (a volte vetro) La superfice da analizzare deve essere di circa 0.2 mm Lo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm (di solito nm) Disidratazione Disidratazione dei campioni tramite passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo Inclusione Inclusione dei campioni in piccoli blocchi di resina Taglioultra- microtomo Taglio dei campioni inclusi con un ultra- microtomo dotato di lama al diamante (a volte vetro) La superfice da analizzare deve essere di circa 0.2 mm Lo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm (di solito nm)

44 Montaggio Montaggio delle sezioni su di una griglia Colorazione delle sezioni Colorazione delle sezioni con nitrato o acetato di uranile e citrato di piombo Visualizzazione Visualizzazione al TEM Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini Montaggio Montaggio delle sezioni su di una griglia Colorazione delle sezioni Colorazione delle sezioni con nitrato o acetato di uranile e citrato di piombo Visualizzazione Visualizzazione al TEM Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini

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48 Freeze-fracture Il tessuto prelevato viene congelato a -140/150 °C Con un martelletto viene provocata la frattura, secondo le linee di forza del tessuto Evaporazione e deposizione di metalli pesanti Eliminazione materia organica

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50 Autoradiografia Utilizzando isotopi radioattivi si possono marcare strutture cellulari ben definite e visualizzarle poi tramite microscopia ottica od elettronica

51 Ottico Elettronico

52 Microscopia Elettronica a Scansione SEM fa una scansione della superfice del campione Produce immagini 3-D SEM fa una scansione della superfice del campione Produce immagini 3-D

53 Preparazione dei campioni per SEM Acquisizione Acquisizione del campione Trattandolo con cura in modo da non danneggiare la superficie Fissazione e disidratazione Fissazione e disidratazione Non Non si include Acquisizione Acquisizione del campione Trattandolo con cura in modo da non danneggiare la superficie Fissazione e disidratazione Fissazione e disidratazione Non Non si include

54 Poggiato su di un supporto e ricoperto con un metallo Oro, cromo, palladio, carbone Deve essere elettron- conducente (non elettrondenso) Visualizzato al microscopio Fotografato Si possono analizzare le componenti chimiche tramite raggi X Poggiato su di un supporto e ricoperto con un metallo Oro, cromo, palladio, carbone Deve essere elettron- conducente (non elettrondenso) Visualizzato al microscopio Fotografato Si possono analizzare le componenti chimiche tramite raggi X

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56 Microscopia a Fluorescenza Il campione viene colorato con anticorpi oppure sostanze specifiche coniugate con fluorocromi La luce utilizzata ha lunghezze donda specifiche per eccitare i fluorocromi I fluorocromi emettono radiazione blu, rossa o verde

57 Microscopia a Fluorescenza

58 Microscopia Confocale La luce monocromatica, di lunghezza donda breve, è emessa da una sorgente laser, attraverso un diaframma e deviata da uno specchio dicroico, che permette il passaggio di determinate lunghezze donda Le lenti dellobbiettivo focalizzano la luce in un punto del piano ottico del campione I fluorocromi usati per colorare vengono eccitati ed emettono a lunghezza donda maggiore, in grado di attraversare lo specchio e focalizzarsi nel piano del diaframma Il foto-moltiplicatore amplifica lintensità del segnale e lo trasmette al computer che elabora limmagine La luce che proviene dai piani superiori o inferiori al piano focale non passa attraverso il diaframma e non contribuisce alla formazione dellimmagine Diversi punti dello stesso piano e dei paini consecutivi vengono illuminati e registrati mediante la scansione col laser

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61 Metodi analitici Come si analizzano gli organelli o la struttura fine? Metodiche che permettono lisolamento dei componenti cellulari intatti Centrifugazione, semplice o differenziale Permette lisolamento sia delle cellule da un tessuto sia delle singole componenti cellulari

62 CentrifugazioneCentrifugazione

63 Centrifugazione differenziale


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