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MICROSCOPIA. OSSERVAZIONE MICROSCOPICA La maggior parte dei microrganismi è troppo piccola per essere vista a occhio nudo (dimensioni dei batteri: 0,3-

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1 MICROSCOPIA

2 OSSERVAZIONE MICROSCOPICA La maggior parte dei microrganismi è troppo piccola per essere vista a occhio nudo (dimensioni dei batteri: 0,3- 5 μ m), pertanto risulta essenziale luso di strumenti, quali i microscopi, che mediante lenti permettono di ingrandire gli oggetti. La maggior parte dei microrganismi è troppo piccola per essere vista a occhio nudo (dimensioni dei batteri: 0,3- 5 μ m), pertanto risulta essenziale luso di strumenti, quali i microscopi, che mediante lenti permettono di ingrandire gli oggetti. Nella visione microscopica, oltre all ingrandimento sono importanti altri due aspetti: la risoluzione e il contrasto. Nella visione microscopica, oltre all ingrandimento sono importanti altri due aspetti: la risoluzione e il contrasto. La risoluzione è la capacità di dare immagini distinte di due punti vicini tra loro; il potere di risoluzione dellocchio umano, nelle migliori condizioni, è di 0,1 mm. La risoluzione è la capacità di dare immagini distinte di due punti vicini tra loro; il potere di risoluzione dellocchio umano, nelle migliori condizioni, è di 0,1 mm. Il contrasto dipende dal grado di rifrazione della luce; essendo la maggior parte delle cellule troppo trasparente per essere distinte dallo sfondo, risulta necessario lutilizzo di colorazioni per aumentarne il contrasto. Il contrasto dipende dal grado di rifrazione della luce; essendo la maggior parte delle cellule troppo trasparente per essere distinte dallo sfondo, risulta necessario lutilizzo di colorazioni per aumentarne il contrasto.

3 MICROSCOPIO SEMPLICE Van Leeuwenhoek (1677)

4 Costituenti del microscopio Ogni microscopio ha come costituenti fondamentali un obiettivo ed un oculare. La distanza tra oculare e loggetto dell'osservazione è invariabile in qualsiasi tipo di microscopio, la messa a fuoco dell'oggetto avviene attraverso lo spostamento del sistema ottico utilizzato. Ogni microscopio ha come costituenti fondamentali un obiettivo ed un oculare. La distanza tra oculare e loggetto dell'osservazione è invariabile in qualsiasi tipo di microscopio, la messa a fuoco dell'oggetto avviene attraverso lo spostamento del sistema ottico utilizzato. L'oggetto viene posto su un vetrino ed illuminato dal basso tramite un condensatore ottico (illuminazione per trasparenza o a campo chiaro) oppure lateralmente (illuminazione in campo scuro). L'oggetto viene posto su un vetrino ed illuminato dal basso tramite un condensatore ottico (illuminazione per trasparenza o a campo chiaro) oppure lateralmente (illuminazione in campo scuro). Per ottenere una maggiore risoluzione può essere aggiunto, tra il preparato e l'obiettivo, un liquido rifrangente (obiettivo a immersione). Per ottenere una maggiore risoluzione può essere aggiunto, tra il preparato e l'obiettivo, un liquido rifrangente (obiettivo a immersione).

5 Microscopio composto a luce trasmessa E composto da: stativo, il supporto meccanico che comprende anche le viti macrometrica e micrometrica per la messa a fuoco stativo, il supporto meccanico che comprende anche le viti macrometrica e micrometrica per la messa a fuoco apparato di illuminazione apparato di illuminazione obiettivo obiettivo oculare oculare

6 OBIETTIVI E OCULARI

7 Losservazione della morfologia (forma Losservazione della morfologia (forma e struttura) dei batteri può essere fatta in due modi: e struttura) dei batteri può essere fatta in due modi: con preparati a fresco con preparati a fresco con preparati afresco con preparati afresco con preparati fissati con preparati fissati con preparati fissati con preparati fissati

8 MICROSCOPIO A CONTRASTO DI FASE Dispositivo ottico capace di convertire differenze di fase in differenze di intensità luminosa, determinando così contrasto nellimmagine (differenze di fase: risultato di piccole differenze nellindice di rifrazione e nello spessore delle diverse parti delle strutture biologiche) Dispositivo ottico capace di convertire differenze di fase in differenze di intensità luminosa, determinando così contrasto nellimmagine (differenze di fase: risultato di piccole differenze nellindice di rifrazione e nello spessore delle diverse parti delle strutture biologiche) Permette losservazione di strutture biologiche vitali, normalmente invisibili, senza dover ricorrere alle colorazioni Permette losservazione di strutture biologiche vitali, normalmente invisibili, senza dover ricorrere alle colorazioni Presenza di due nuovi elementi: diaframma anulare e piastra di fase Presenza di due nuovi elementi: diaframma anulare e piastra di fase

9 Osservazione a contrasto di fase Un batterio (Lb. sakei) Un lievito (S. cerevisiae) Una muffa (G. candidum)

10 MICROSCOPIO A FLUORESCENZA Sorgente di luce ultravioletta Sorgente di luce ultravioletta Condensatore con lenti di quarzo: permettono il passaggio della luce UV Condensatore con lenti di quarzo: permettono il passaggio della luce UV Obiettivo con lenti di vetro: trattengono le radiazioni UV permettendo il passaggio della radiazione visibile formatasi per fluorescenza Obiettivo con lenti di vetro: trattengono le radiazioni UV permettendo il passaggio della radiazione visibile formatasi per fluorescenza Fluorescenza primaria: prodotta naturalmente dal preparato (clorofilla) Fluorescenza primaria: prodotta naturalmente dal preparato (clorofilla) Fluorescenza secondaria: indotta dal trattamento con sostanze fluorescenti (fluorocromi) Fluorescenza secondaria: indotta dal trattamento con sostanze fluorescenti (fluorocromi)

11 MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE (TEM)

12 Caratteristiche Fascio di elettroni per illuminare il preparato Fascio di elettroni per illuminare il preparato Presenza di lenti elettromagnetiche Presenza di lenti elettromagnetiche Potere di risoluzione: 20Å (100 volte superiore a quello del microscopio ottico) Potere di risoluzione: 20Å (100 volte superiore a quello del microscopio ottico) Ingrandimenti diretti sino a e con ulteriore ingrandimento della fotografia sino a Ingrandimenti diretti sino a e con ulteriore ingrandimento della fotografia sino a Valido mezzo per studiare lultrastruttura dei microrganismi, ma non allo stato vitale: i campioni devono essere disidratati, tagliati in sezioni ultrasottili e ricoperti con metalli pesanti. Valido mezzo per studiare lultrastruttura dei microrganismi, ma non allo stato vitale: i campioni devono essere disidratati, tagliati in sezioni ultrasottili e ricoperti con metalli pesanti.

13 Fotografie di cellule batteriche al microscopio elettronico a trasmissione

14 MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE (SEM)

15 Caratteristiche Fascio di elettroni per illuminare il preparato Fascio di elettroni per illuminare il preparato Usato per lesame dettagliato delle superfici dei microrganismi Usato per lesame dettagliato delle superfici dei microrganismi Ingrandimenti che vanno da quelli delle comuni lenti dingrandimento sino a Ingrandimenti che vanno da quelli delle comuni lenti dingrandimento sino a Potere di risoluzione: 200Å ( inferiore a quello del TEM) Potere di risoluzione: 200Å ( inferiore a quello del TEM) Vantaggio principale: formare unimmagine tridimensionale delloggetto Vantaggio principale: formare unimmagine tridimensionale delloggetto

16 Fotografie di cellule di E. coli al microscopio elettronico a scansione

17 Colorazioni batteriche

18 Per osservare i batteri si usano i coloranti Per osservare i batteri si usano i coloranti Colorare i batteri consente di: Colorare i batteri consente di: vedere maggiore contrasto tra lorganismo e lo sfondo, vedere maggiore contrasto tra lorganismo e lo sfondo, differenziare vari tipi morfologici (tramite la forma, la disposizione, la colorazione, etc.), differenziare vari tipi morfologici (tramite la forma, la disposizione, la colorazione, etc.), osservare determinate strutture (flagelli, capsule, endospore, etc.). osservare determinate strutture (flagelli, capsule, endospore, etc.).

19 Sono generalmente sali (un sale è un composto costituito da uno ione carico positivamente ed uno carico negativamente) nei quali uno dei due ioni è colorato. Sono generalmente sali (un sale è un composto costituito da uno ione carico positivamente ed uno carico negativamente) nei quali uno dei due ioni è colorato. Ad esempio il blu di metilene è il sale cloruro di metilene che in acqua si dissocerà nello ione blu metilene carico positivamente e lo ione cloruro incolore carico negativamente. Ad esempio il blu di metilene è il sale cloruro di metilene che in acqua si dissocerà nello ione blu metilene carico positivamente e lo ione cloruro incolore carico negativamente. Per capire come funziona un colorante, è bene capire la natura fisica e chimica dei coloranti

20 I coloranti possono essere divisi in due gruppi: quelli basici e quelli acidi I coloranti possono essere divisi in due gruppi: quelli basici e quelli acidi Se la parte colorata del colorante è uno ione positivo viene detto basico (ad esempio: il blu di metilene, il cristal violetto, la safranina). Se la parte colorata del colorante è uno ione positivo viene detto basico (ad esempio: il blu di metilene, il cristal violetto, la safranina). Se la parte colorata è lo ione carico negativamente esso è acido (ad esempio: la nigrosina, il rosso congo). Se la parte colorata è lo ione carico negativamente esso è acido (ad esempio: la nigrosina, il rosso congo).

21 A causa della loro natura chimica, i citoplasmi di tutte le cellule batteriche hanno una debole carica negativa se fatte crescere in un mezzo a pH neutro. Perciò, quando si usa un colorante basico, lorganismo si colorerà direttamente. A causa della loro natura chimica, i citoplasmi di tutte le cellule batteriche hanno una debole carica negativa se fatte crescere in un mezzo a pH neutro. Perciò, quando si usa un colorante basico, lorganismo si colorerà direttamente. Un colorante acido, invece, forma un deposito attorno allorganismo, lasciando lorganismo incolore. Dal momento che lorganismo viene visto indirettamente questo tipo di colorazione è detta indiretta o negativa, ed è usata per ottenere una più accurata visione della dimensione, della forma e della disposizione dei batteri. Un colorante acido, invece, forma un deposito attorno allorganismo, lasciando lorganismo incolore. Dal momento che lorganismo viene visto indirettamente questo tipo di colorazione è detta indiretta o negativa, ed è usata per ottenere una più accurata visione della dimensione, della forma e della disposizione dei batteri.

22 Come is colorano i batteri Molti batteri mancano di colore o di strutture interne contrastanti. Dal momento che la densità di molti batteri è solo un po più alta di quella dell acqua, i batteri is vedono difficilmente in sospensione liquida usando un microscopio a campo luminoso perché sono quasi trasparenti.

23 Allestimento di un vetrino La preparazione di uno striscio è richiesto nella maggior parte dei procedimenti di laboratorio, prima della colorazione. Ha come finalità di fissare i batteri a un vetrino, evitando che esse siano perse durante il processo di colorazione propriamente detto. Lo striscio può essere preparato a partire dalle colonie cresciute in mezzi solidi o a partire da un mezzo liquido. La preparazione di uno striscio è richiesto nella maggior parte dei procedimenti di laboratorio, prima della colorazione. Ha come finalità di fissare i batteri a un vetrino, evitando che esse siano perse durante il processo di colorazione propriamente detto. Lo striscio può essere preparato a partire dalle colonie cresciute in mezzi solidi o a partire da un mezzo liquido.

24 METODICA Prelevare con un ansa sterile un po di materiale batterico da una colonia isolata. Prelevare con un ansa sterile un po di materiale batterico da una colonia isolata. Distendere il materiale su un vetrino dove era stata precedentemente messa una goccia di acqua distillata. Distendere il materiale su un vetrino dove era stata precedentemente messa una goccia di acqua distillata. Essiccamento: lasciare asciugare a temperatura ambiente fino a completa evaporazione dellacqua. Essiccamento: lasciare asciugare a temperatura ambiente fino a completa evaporazione dellacqua. Fissazione: passare velocemente il vetrino, tenuto con una pinza, sulla zona più calda della fiamma del becco bunsen, per almeno tre volte. Fissazione: passare velocemente il vetrino, tenuto con una pinza, sulla zona più calda della fiamma del becco bunsen, per almeno tre volte.

25 Le colorazioni possono essere semplici monocromatiche o differenziate

26 Colorazioni semplici Rendono le cellule meglio evidenziabili all'osservazione microscopica. Richiedono l'uso di un solo colorante (es. blu di metilene, cristal violetto, fucsina basica). Rendono le cellule meglio evidenziabili all'osservazione microscopica. Richiedono l'uso di un solo colorante (es. blu di metilene, cristal violetto, fucsina basica). La colorazione semplice è utilizzata per la valutazione della forma, della disposizione e delle dimensioni dei batteri, non consente però di evidenziare i dettagli della struttura interna. La colorazione semplice è utilizzata per la valutazione della forma, della disposizione e delle dimensioni dei batteri, non consente però di evidenziare i dettagli della struttura interna.

27 COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE OBIETTIVO: Osservare la forma di diversi microrganismi utilizzando una colorazione semplice. OBIETTIVO: Osservare la forma di diversi microrganismi utilizzando una colorazione semplice. PRINCIPIO: I coloranti usati in microbiologia sono sostanze organiche nelle quali sono presenti gruppi funzionali detti cromofori associati alla produzione di colore. Si distinguono in coloranti basici (blu di metilene, violetto di genziana, safranina) e acidi (nigrosina, fucsina acida). La colorazione aumenta il contrasto con lambiente rendendo più visibili le cellule. Poiché i batteri sono ricchi di acidi nucleici, si colorano molto bene con coloranti basici come il blu di metilene. PRINCIPIO: I coloranti usati in microbiologia sono sostanze organiche nelle quali sono presenti gruppi funzionali detti cromofori associati alla produzione di colore. Si distinguono in coloranti basici (blu di metilene, violetto di genziana, safranina) e acidi (nigrosina, fucsina acida). La colorazione aumenta il contrasto con lambiente rendendo più visibili le cellule. Poiché i batteri sono ricchi di acidi nucleici, si colorano molto bene con coloranti basici come il blu di metilene.

28 METODICA Dopo aver appoggiato il vetrino su una vaschetta per la colorazione, aggiungere qualche goccia di blu di metilene. Attendere circa 3 minuti, quindi lavare con acqua mediante una spruzzetta. Eliminare buona parte dellacqua di lavaggio inclinando il vetrino; asciugare delicatamente, prima con carta da filtro, poi allaria. Dopo aver appoggiato il vetrino su una vaschetta per la colorazione, aggiungere qualche goccia di blu di metilene. Attendere circa 3 minuti, quindi lavare con acqua mediante una spruzzetta. Eliminare buona parte dellacqua di lavaggio inclinando il vetrino; asciugare delicatamente, prima con carta da filtro, poi allaria. COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE

29 RISULTATO COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE

30 Colorazioni complesse Richiedono l'uso di più coloranti. Mettono in evidenza non solo la morfologia, ma anche determinate caratteristiche di gruppi di microrganismi (colorazioni differenziali). Richiedono l'uso di più coloranti. Mettono in evidenza non solo la morfologia, ma anche determinate caratteristiche di gruppi di microrganismi (colorazioni differenziali). In generale, i batteri hanno una affinità per un grande numero di coloranti principalmente si tratta dei derivati basici dellanilina (blu di metilene, cristal violetto, fucsina basica, ecc.). In generale, i batteri hanno una affinità per un grande numero di coloranti principalmente si tratta dei derivati basici dellanilina (blu di metilene, cristal violetto, fucsina basica, ecc.). Fra i metodi esistenti, quelli piu importanti in un laboratorio di microbiologia sono il metodo di GRAM e il metodo di ZIEHL-NEELSEN. Fra i metodi esistenti, quelli piu importanti in un laboratorio di microbiologia sono il metodo di GRAM e il metodo di ZIEHL-NEELSEN.

31 COLORAZIONE DI GRAM GRAM POSITIVI GRAM NEGATIVI FISSAZIONE CRISTAL VIOLETTO LIQUIDO DI LUGOL DECOLORAZIONE COLORAZIONE DI CONTRASTO (SAFRANINA) Le cellule vengono colorate con un colorante basico quale il cristal violetto e successivamente trattate con liquido di Lugol (iodio sciolto in una soluzione di ioduro di potassio). Fino a questo punto tutte le forme microbiche appaiono colorate. Se si lava con alcol, si osserva che alcune specie si decolorano (Gram-) e altre no (Gram+). Le prime possono essere evidenziate usando un colorante di contrasto (es. safranina o fuxina).

32 GRAM+ GRAM- RISULTATO

33 FAMIGLIE DI BATTERI GRAM+ E GRAM- MICRORGANISMIGRAMFORMA MICROCOCCHI+ AMMASSI di COCCHI STAFILOCOCCHISTREPTOCOCCHI++ COCCHI a GRAPPOLI COCCHI a CATENELLE BACILLI+BASTONCELLARI CLOSTRIDI+BASTONCELLARI CORYNEBATTERIA+BASTONCELLARI MYCOBATTERI+BASTONCELLARI BRUCELLA-BASTONCELLARI COLIFORMI-BASTONCELLARI PSEUDOMONAS-BASTONCELLARI AEROMONAS-BASTONCELLARI

34 METODO DI ZIEHL-NEELSEN si basa sulla caratteristica di alcool-acido resistenza di determinati batteri come il Mycobacterium tuberculosis che permette di trattarli con una soluzione di fucsina fenicata a caldo o a freddo. Tali batteri resistono al trattamento posteriore con una soluzione di alcool-acido cloridrico (HCl 3% in etanolo) e ritengono la colorazione iniziale rossa, mentre altri si decolorano e assumono la colorazione di fondo, normalmente fatta con blu di metilene 0,3% o verde malachite. N:B: I vetrini vanno ben fissati preferibilmente alla fiamma del becco Bunsen o lasciati in termostato overnight. N:B: I vetrini vanno ben fissati preferibilmente alla fiamma del becco Bunsen o lasciati in termostato overnight.

35 COLORAZIONE CON FLUOROCROMO AURAMINA-O Procedimento: Procedimento: Coprire i preparati con una soluzione di Auramina O e lasciare agire per 15 minuti a temperatura ambiente; Coprire i preparati con una soluzione di Auramina O e lasciare agire per 15 minuti a temperatura ambiente; lavare i vetrini in acqua corrente; lavare i vetrini in acqua corrente; coprire i vetrini con soluzione decolorante per 2 minuti; coprire i vetrini con soluzione decolorante per 2 minuti; lavare i vetrini in acqua corrente; lavare i vetrini in acqua corrente; coprire i vetrini con una soluzione di permanganato di potassio e lasciare agire per 3 minuti; coprire i vetrini con una soluzione di permanganato di potassio e lasciare agire per 3 minuti; lavare i vetrini in acqua corrente; lavare i vetrini in acqua corrente; lasciare seccare a temperatura ambiente; lasciare seccare a temperatura ambiente; osservare i preparati al microscopio a fluorescenza, con un obiettivo di 40x, al piu presto possibile. osservare i preparati al microscopio a fluorescenza, con un obiettivo di 40x, al piu presto possibile.

36 COLORAZIONE CON FLUOROCROMO AURAMINA-O I micobatteri appaiono colorati in verde fluorescente, contro un fondo castano.

37 Colorazione spore (secondo Schaeffer-Fulton) Allestire e fissare un vetrino Allestire e fissare un vetrino Appoggiare il vetrino su un sostegno sopra una vaschetta contenente acqua la quale verrà portata allebollizione. Appoggiare il vetrino su un sostegno sopra una vaschetta contenente acqua la quale verrà portata allebollizione. Colorare abbondantemente con verde malachite, lasciare il vetrino esposto al vapore che si sviluppa per 3-5 e aggiungere ancora il colorante facendo attenzione che il vetrino non rimanga a secco. (per evitare che il vetrino cada nella vaschetta trattenerlo con una pinza di legno). Colorare abbondantemente con verde malachite, lasciare il vetrino esposto al vapore che si sviluppa per 3-5 e aggiungere ancora il colorante facendo attenzione che il vetrino non rimanga a secco. (per evitare che il vetrino cada nella vaschetta trattenerlo con una pinza di legno). Lavare con acqua e colorare con safranina per 5. Dopo aver lavato abbondantemente con acqua asciugare delicatamente. Lavare con acqua e colorare con safranina per 5. Dopo aver lavato abbondantemente con acqua asciugare delicatamente.

38 RISULTATO Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino allobiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno. Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino allobiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno. spore appariranno colorate con verde malachite, le altre parti della cellula con safranina

39 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLA CAPSULA OBIETTIVO: Osservare la presenza di batteri capsulati utilizzando una colorazione che, non richiedendo fissazione, permette una visione senza artefatti della morfologia batterica. OBIETTIVO: Osservare la presenza di batteri capsulati utilizzando una colorazione che, non richiedendo fissazione, permette una visione senza artefatti della morfologia batterica. PRINCIPIO: La capsula dei batteri non ha alcuna affinità per i coloranti perciò per metterla in evidenza si fa ricorso a colorazioni negative. PRINCIPIO: La capsula dei batteri non ha alcuna affinità per i coloranti perciò per metterla in evidenza si fa ricorso a colorazioni negative.

40 METODICA Deporre una goccia di inchiostro di china diluito al 10% su un vetrino portaoggetti. Prelevare con un ansa sterile un po di materiale batterico da una colonia isolata. Deporre una goccia di inchiostro di china diluito al 10% su un vetrino portaoggetti. Prelevare con un ansa sterile un po di materiale batterico da una colonia isolata. Sospendere il materiale sullinchiostro di china e coprire con un vetrino coprioggetto. Sospendere il materiale sullinchiostro di china e coprire con un vetrino coprioggetto. Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino allobiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno. Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino allobiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno.

41 RISULTATO I granuli molto fini di colorante determinano uno sfondo semiopaco nel quale spiccano le capsule chiare.


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