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IDROCARBURI POLICICLICI AROMATICI TOSSICOLOGIA E BIOMONITORAGGIO DELLESPOSIZIONE.

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1 IDROCARBURI POLICICLICI AROMATICI TOSSICOLOGIA E BIOMONITORAGGIO DELLESPOSIZIONE

2 IDROCARBURI POLICICLICI AROMATICI

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4 PAHs SOURCES OF EXPOSURE NATURAL OCCURRENCE Air (industrial and ambient), water, food, soil, sediments, aquatic organisms, mineral oils, cigarette smoke OCCUPATIONAL EXPOSURE The occupations in which there is exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons: High exposure: coke ovens coal gasification plants chimney sweeping petroleum refineries impregnation of wood with creosotes handling of creosote-impregnated wood (e.g. railroad and utility workers, carpenters) Medium exposure: asphalt and pavement work roofing aluminium production graphite electrode production founding (processing of e.g. steel and other alloys, form coal additives in moulding sand) smokehouses (processing of meat and fish) Low exposure: mechanics, bus garage workers, and machinists (from diesel and spark-ignition engine exhaust gases) mining use of lubricating and cutting oils (e.g. in steel production) cooking References: IPCS (1998) Environmental Health Criteria 202 Selected non-heterocyclic polycyclic aromatic hydrocarbons, WHO, Geneva IARC (1983) IARC Monographs on the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals in humans, Polynuclear aromatic compounds, Part.1, Chemical, Environmental and Experimental Data, Lyon

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10 Items with the highest concentration of BaP were The BaP concentrations of the various food items are as ng/g or ppm very well done grilled/barbecued steak well done grilled/barbecued chicken with skin, 4.57 very well done grilled/barbecued hamburger, 0.56 – 1.52 pop corn0.56 well done oven-broiled chicken boneless0.48 well done grilled/barbecued chicken boneless0.40 collard greens and kale 0.48 pumpkin pie, 0.47 pretzels0.37 bran (fibra/ cellulosa) and granola cereal, 0.31 – 0.30 foodstuff cooked cereal, 0.31 pesce persico oven broiled0.24 pan fried or grilled/barbecued0.15 Pizza 0.23 French fries margarine 0.12

11 The descending order for BaP concentration among the top ten items with the highest concentrations of BaP in a "medium" portion size (ng/medium portion size) very well done grilled/barbecued steak, (100g) well done grilled/barbecued chicken with skin, 439 very well done grilled/barbecued hamburger, well done oven-broiled chicken boneless46 well done grilled/barbecued chicken boneless37-38 pesce persico well – very well oven broiled pan fried or grilled/barbecued13 pumpkin pie (torta/ pasticcio di zucca), 63 pasti a base di cream di grano o farina davena50-20 spaghetti20 collard and kale (cavolo verde (brassica oleifela),43-43 pepperoni pizza, 28 (121g) orange/ tangerine 23 tomato.23

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16 POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS: TOXICOLOGY Carcinogenicity

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22 AGENZIA INTERNAZIONALE PER LA RICERCA SUL CANCRO (I.A.R.C) DI LIONE VALUTAZIONE SULLUOMO (EPIDEMIOLOGICA)

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32 SOPRATUTTO CON LE FECI

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35 ESEMPI DI TOXIC EQUIVALENCY FACTOR VALUES (Larsen & Larsen, 1998) antatrene 0.3 fenantrene benzo(a)antracene fluorantene 0.05 benzo(a)pirene 1 ciclopenta(c,d)pirene 0.02 dibenzo(a,h)antracene 1.1 dibenzo(a,l)pirene 1

36 TEF E SUO UTILIZZO AMBIENTALE B(a)P 1 ng/m3 per laria urbana

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42 coke oven workers 0.71% di ng/m 3 di sostanza estraibile in benzene 1420 ng/m 3 RR = ng 1.3/1420 = RR = = 9 x 10 -5

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47 E QUINDI NE DERIVA ANCHE PER I POLINUCLEARI AROMATICI QUANTO DETTO PER GLI ALTRI CANCEROGENI GENOTOSSICI E CIOE UN LIVELLO TENDENZIALE DI ESPOSIZIONE CONSENTITA UGUALE A ZERO

48 MONITORING EXPOSURE FOR GENOTOXIC AGENTS EXPOSURE LEVELS WILL TEND TO = 0 Thus we expected lowering concentrations both in the environment and in the biological fluids In most cases there is the necessity to have sensitive biomonitoring procedures

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51 prevenzione primaria valutazione del rischio sorveglianza sanitaria La nostra posizione e… monitoraggio ambientale monitoraggio biologico registro degli esposti

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54 INDICATORI BIOLOGICI DI RISCHIO GENOTOSSICO -SOSTANZA O SUOI METABOLITI Dose interna -mutagenicità sostanze escrete -ADDOTTI AL DNA Dose biologicamente efficace -addotti alle proteine -aberrazioni cromosomiche -scambi tra cromatidi fratelli -micronuclei -mutanti HPRT INDICATORI DI ESPOSIZIONE INDICATORI DI EFFETTO

55 d.Elimination Most metabolites of PAH are excreted in faeces and urine.

56 METABOLITI URINARI TEST ASPECIFICI: TIOETERI URINARI MUTAGENI URINARI

57 Tioeteri urinari Test di esposizione che consiste nella determinazione complessiva di tioeteri o disolfuri nellurina esposti originati dalla reazione fra composti genotossici e glutatione Limiti: aspecifico (es. fumo, benzene, 1,3- butadiene, acrilonitrile, stirene, toluene) scarsa sensibilità basse dosi

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66 - trans-anti-BaP-tetrolo (Simpson et.al. 2000) - trans-anti-fenantrene-tetrolo (Hecht et al.2003)

67 NESSUNO DI QUESTI METABOLITI URINARI HA RILEVANZA RISPETTO AL RISCHIO CANCEROGENO SONO SOLO DEGLI INDICATORI DI DOSE INTERNA

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70 THE TOTAL PAH LEVELS DETERMINED BY THE ACIDIC DECONJUGATION/REDUCTION METHOD WERE CONFIRMED TO BE NEARLY ALWAYS LOWER THAN THE CORRESPONDING LEVELS OF 1-OH PYR ALONE. Clonfero et al. Int Arch Occup Environ Health (1989) 61:

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75 POSSIBILE LA MISURA DIRETTA DEL GLUCURONIDE

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78 OO PERCHE E HA IL VANTAGGIO CHE

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80 IDROCARBURI POLICICLICI AROMATICI

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90 Table III. Representative concentrations of biomarkers in smokers' urine (Hecht, 2002) BiomarkerAmountPrecursorReference (nmol/24 h)(ng/cigarette) 2-Naphthol73 a 2000–4000(44) 3-Hydroxyphenanthrene3.185–620(52) 1-Hydroxypyrene1.650–270(65) trans-anti-BaP-tetraol (79) a Estimate based on 1.5 l urine excreted per day.

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98 Smokers Non-smokers *median LEVELS OF 1-PYRENOL IN GENERAL POPULATION NOT OCCUPATIONAL EXPOSED TO PAHs

99 LEVELS OF 1-PYRENOL IN PEOPLE NOT SMOKERS NOT OCCUPATIONALLY EXPOSED TO PAHS Nation Number of subjects 1-pyrenol µmoles /mole crea

100 ATTENZIONE CONTINUITA DI ESPOSIZIONE TRE GIORNI CONTINUATIVI ALMENO

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105 IN OGNI CASO LUTILIZZO DI QUESTO INDICATORE PER IL MONITORAGGIO BIOLOGICO E MEGLIO DI NIENTE

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109 Copyright ©2003 American Association for Cancer Research Hecht, S. S. et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003;12:

110 Copyright ©2003 American Association for Cancer Research Hecht, S. S. et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003;12:

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112 MISURA DEGLI ADDOTTI AL DNA E INDICATORI CITOGENETICI NEL BIOMONITORAGGIO DELLESPOSIZIONE AD IDROCARBURI POLICICLICI AROMATICI

113 RjX = genotossico elettrofilo Yj Yj = Nucleofili atomi O, NDNA + Addotti al DNA = legame covalente tra i siti elettrofili del cancerogeno finale + i siti nucleofili di DNA Definizione molecolare RjX + YjRjX - Yj adducts

114 Siti nucleofili al DNA

115 Storia degli addotti al DNA 1964 Nature 202:781. Brookes and Lawley Dimostrazione del legame tra IPA e il DNA nella pelle di topo Biochemistry 110: 159. Grover and Sims (UK) e Gelboin (USA) Attivazione metabolica degli IPA necessaria per lattacco al DNA 1974 Sims and Grover Nature 252:326. Lattivazione del BaP passa attraverso la formazione di epossidi 1996 Denissenko MF, Pao A, Tang M, Pfeifer GP. Science Oct 18;274(5286): Addotti al DNA del BPDE coincidono con hot spot mutazione su P53 nel cancro al polmone nei fumatori

116 MPO CYP4 50 EH CYP4 50 MPO EH Vie di attivazione genotossica del Benzo[a]Pirene

117 Le tecniche di misura degli addotti IPA (BaP) DNA possono essere schematicamente suddivise in: 1) metodi immunochimici; 2) metodi immunocitochimici; 3) metodi biochimici di post-marcatura con 32 P; 4) metodi fisico-chimici.

118 Haugen A, Becher G, Benestad C, Vahakangas K, Trivers GE, Newman MJ, Harris CC. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in the urine, benzo(a)pyrene diol epoxide-DNA adducts in lymphocyte DNA, and antibodies to the adducts in sera from coke oven workers exposed to measured amounts of polycyclic aromatic hydrocarbons in the work atmosphere. Cancer Res Aug;46(8): UTILITA DELLA DOSIMETRIA DEGLI ADDOTTI AL DNA NEL BIOMONITORAGGIO

119 Svantaggi sono rappresentati dall'esistenza di fenomeni di reattività crociata degli anticorpi anti-addotto BPDE-DNA, che rendono difficile la sua quantificazione specifica, e dalla lunga e laboriosa fase di preparazione degli anticorpi. reazioni antigene-anticorpo anti addotto BPDE-DNA METODI IMMUNOCHIMICI RIA (Radio Immuno Assay) ELISA (Enzime-Linked Immunosorbent Assay) USERIA (Ultra-Sensitive Enzyme Radio-Immuno Assay) CIA (chemiluminescence immunoassay)

120 (micrococcal nuclease (MN)/ rate phosphodiesterase (SPD)) 3-6 h a 37°C Nucleasi P1 1 digestione 2 arrichimento 3 marcatura butanolo 4 Cromatografia su strato sottile (3 giorni), 5 Autoradiografia (giorni-ore) 6 Localizzazione degli post radioattivi,7 Quantificatione mediante conte scintillometriche Post-marcatura con 32 P

121 D1: bifosfato di sodio 1M pH 6.8 (16h) D2=formiato di litio 5.4M, urea 8.5 M pH 3.5 (6 h) D3= cloruro di litio 1.2M, Tris- HCl 0.5M, urea 8.5 M pH 8.0 (6h) D4= bifosfato di sodio 1.7 M pH 6.0 (16h)

122 Anti-BPDE-DNA di linfociti trattati in vitro DNA soggetto di controllo DNA lavoratore i cokeria Post-marcatura con 32 P Pavanello et al., 1994

123 NUCLEASI P1 BUTANOLO PAVANELLO ET AL., 1992 Post-marcatura con 32 P

124 Metodo aspecifico Analisi lunga e costosa Post-marcatura con 32 P

125 METODO DI MISURA SPECIFICO DELLADDOTTO ANTI-BPDE-DNA Il primo metodo messo a punto analisi addotti BaP-DNA (Weinstein, 1983) HPLC-SPETTROFOTOMETRIA UV bassa sensibilità (1 addotto/10 5 nucleotidi) elevata quantità di DNA (1000µg) HPLC/FLUORESCENZA (Alexandrov et al., 1992) La sensibilità è di circa 1 addotto/10 8 nucleotidi, Media quantità di DNA 100µg di DNA Vantaggi no uso di composti radioattivi o anticorpi, relativamente semplice e rapida nella preparazione dei campioni non distruttiva nei confronti del composto determinato.

126 HPLC/fluorescence analysis of anti-B[a]PDE-DNA adducts DNA µg/ml from lymphomonocyte fraction BPDE-tetrol concentration in a C18 pre-column BPDE-Tetrols separation in a analytic C18 column, isocratic elution 55% methyl alcohol campionatore automatico switching valvola Fluorescence excitation and emission wavelengths were set at 344 nm and 398 nm BP-7,8-diol- 9,10-epoxido (BPDE) OH OHOH Detection of tetrols by fluorescence Alexandrov et al., 1992 Automazione completa Minimizzare la variabilità Analizzare un numero elevato di campioni Acid hydrolysis with HCl 0.1N 90°C for 4 hours Pavanello et al., 2004 Pavanello et al., 2005

127 (anti-B[a]PDE) HPLC- fluorescence AREA PG TETROLO anti-BPDE MINUTES FLUORESCENCEFLUORESCENCE identificazione quantificazione

128 Metodi per analisi di addotti al DNA: confronto di sensibilità

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130 Tessuti facilmente disponibili nel biomonitoraggio Cellule nucleate del sangue periferico µg Mucosa buccale, cervicale, uroteliali10-50µg Sputo o saliva10-100µg Macrofagi da lavaggi broncoalveolari 10-00µg Cellule germinali maschili 10-50µg Cellule bulbo capelli 10-50µg

131 rappresentano una misura dell'esposizione a BaP accumulata in un lungo periodo di tempo (settimane- mesi) il metabolismo dello xenobiotico al livello epatico (equilibrio tra l'attivazione e la detossificazione del cancerogeno) la riparazione dell'addotto (danno al DNA) che risulta dal legame covalente dei metaboliti finali al DNA morte cellulare stima contemporaneamente le varie vie di esposizione studi di epidemiologia molecolare mostrano una correlazione significativa tra i livelli di addotti nella LMF e nel tessuto polmonare dei fumatori (Tang et al., 1995; Wiencke et al., 1995; Wiencke et al., 1999) Significato dell addotto BaP-DNA nelle cellule bianche mononucleate di sangue periferiferico

132 Addotti aromatici-DNA indicatore di rischio di cancro al polmone in studi prospettici predittivi dello sviluppo di tumore al polmone tra i fumatori (Tang et al., 2001;Perera et al., 2002) tra i non fumatori esposti ambientali (Peluso et al., 2005)

133 IPA (BaP)- DNA Lymphomonocytes of peripheral blood Esposizione Dosimetria degli addotti DNA nel biomonitoraggio dellesposizione umana ad Idrocarburi Policiclici Aromatici Vie di introduzione

134 ESPOSIZIONE OCCUPAZIONALE IPA: ADDOTTI AROMATICI AL DNA POPOLAZIONI STUDIATE: COKERIA 21 FONDERIA 4 ALLUMINIO 9 SPAZZACAMINI2 AUTOTRASPORTATORI1 AUTISTI AUTOBUS 2 VIGILI3 POSTINI MEDLINE database (National Center for Biotechnology Information. PubMed Database:

135 Esposizione ambientale FUMO DI TABACCO45 OUTDOOR(inquinanti del traffico)4 DIETA (carne cotta alla griglia, pizza)2 INDOOR MEDLINE database (National Center for Biotechnology Information. PubMed Database:

136 La dosimetria degli addotti al DNA appare una tecnica promettente per la valutazione dellesposizione ad IPA ma non è attualmente una metodica utilizzabile nelle pratiche di biomonitoraggio di routine di questa esposizione professionale.

137 Esposizione Dose interna Dose al bersaglio Effetti biologici preclinici precoci Malattia Composto o suoi metaboliti Mutageni utrinari Addotti DNAAberrazioni cromosomiche Micronuclei SCE Attivazione oncogeni Inattivazione geni soppressori PROCESSO MULTISTADIO DI CANCEROGENESI Percorso di un genotossico allinterno dell organismo Indicatori di dose Indicatori di dose efficace Indicatori di effetto

138 ESPOSIZIONE OCCUPAZIONALE IPA: micronuclei COKERIA 2/7 Fumo>30 sigarette MEDLINE database (National Center for Biotechnology Information. PubMed Database:

139 ESPOSIZIONE OCCUPAZIONALE AD IPA: SCE COKERIA 8/13 Fumo6/ MEDLINE database (National Center for Biotechnology Information. PubMed Database:

140 ESPOSIZIONE OCCUPAZIONALE IPA: Aberrazioni Cromosomiche COKERIA 4/7 Fumo4/ MEDLINE database (National Center for Biotechnology Information. PubMed Database:

141 Da limitare a gruppi di soggetti ad altissima esposizione Indicatori apecifici, fumo fattore confondente Bioindicatori di danno al DNA alcuni di danno grave correlato ad una aumentata incidenza di tumori (AC, MN ?)

142 POLIMORFISMI GENETICI NEL BIOMONITORAGGIO DELLESPOSIZIONE AD IDROCARBURI POLICICLICI AROMATICI

143 EsposizioneDose interna Dose al bersaglio Effetti biologici preclinici precoci Malattia Composto o suoi metaboliti Addotti al DNA e alle proteine Aberrazioni cromosomiche Micronuclei SCE, COMET assay - METABOLISMO ATTIVAZIONE/DETOSSIFICAZIONE - RIPARAZIONE DEL DNA MEDLINE database (National Center for Biotechnology Information. PubMed Database: Suscettibilità individuale ai genotossici

144 MPO

145 GST (GSTM1, P1) Non genotoxic coniugates

146 METABOLISMO DEL PIRENE SIMILE AL BaP IDROSSILAZIONE CONIUGAZIONE CON GSH, AC. GLUCURONICO AUMENTO DEI GLUCURONIDI PER DIMINUZIONE ATTIVITA GLUTATIONE S-TRANSFERASICA AUMENTO DEI TIOETERI PER AUMENTO ATTIVITA GLUTATIONE S-TRANSFERASICA

147 Polimorfismo genetico La variabilità è dovuta al fatto che in una popolazione numerosi geni sono presenti in forme alleliche diverse 1/3 dei geni umani sono polimorfici alleli = geni variabili polimorfismo genetico: fenotipo differente che si presenta in almeno 1-2% della popolazione totale se la frequenza è al di sotto varianti rare o mutazioni

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149 Normal Decrease? Increased activity in smokers Wild type G A T delT-2464 A C -164 *1 *1C *1D *1F CYP1A2 a (cytochrome P450 1A2) Normal Increased Wild type T C 6235 A G 4889 T C 5639 C A 4887 *1 *2 or Msp1 *3 or Ile/Val *4 *5 CYP1A1 a (cytochrome P450 1A1) Enzyme activityMutationAlleleGene (enzyme) Normale Diminuisce Aumento Wild type Esone 3 –Tyr 113His Esone 4 –His139Arg R o *1 H Y EPHX (epossido idrolasi) 10% CAUCASICI 5% CAUCASICI 30% 60% POLIMORFISMI DI GENI NEL METABOLISMO DEGLI IPA

150 50 % 10 %

151 POLIMORFISMI GENI DELLA RIPARAZIONE NER E APOPTOSI DIMINUZIONE ATTIVITA ENZIMATICA 30% 40% 45% 34% 45% FREQUENZA ALLELICA A670G Enhancer region Asp312Asn Exon 10 Lys751Gln Exon 23 A23G 5 non coding region PAT-/+ Insertion/deletion 83 bases Intron 9 POLIMORFISMO FAS XPD XPA XPC Gene

152 CYP1A1*1/*2 o *2/*2; GSTM1 *0/*0 1-Pirenolo urinario Indicatori di dose interna GSTM1 *0/*0 CYP1A1 *1/*2 o *3 e *2/*2 o *5 XPC- PAT +/+ and XPA- A23A BPDE-DNA (HPLC- fluorescenza) NAT2 ss + GSTM1*0/*0 Addotti aromatici (diesel) al DNA (32P) GSTM1 *0/*0; EPHX *Tyr/Tyr GSTP1 *Val/Val XRCC1 cggg aplotipo MNIndicatori di effetto GSTM1 *0/*0 DA SOLO O IN COMBINAZIONE CON CYP1A1 *1/ *3 E *2/*2 XPD 751 Gln/Gln e Gln/Lys Addotti aromatici al DNA (32P) Indicatori di dose biologicamente efficace Genotipi (fenotipi) che aumentano lindicatore di rischio genotossico nellesposizione ad IPA

153 Chromosomal Aberrations in Lymphocytes Predict Human Cancer Independently of Exposure to Carcinogens Stefano Bonassi,2 Lars Hagmar, Ulf Stro¨ mberg, Alicia Huici Montagud, Håkan Tinnerberg, Alessandra Forni, Pirjo Heikkila¨, Saskia Wanders, Peter Wilhardt, Inger-Lise Hansteen, Lisbeth E. Knudsen, and Hannu Norppa, for the European Study Group on Cytogenetic Biomarkers and Health Department of Environmental Epidemiology, Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, I Genova, Italy [S. B.]; Department of Occupational and Environmental Medicine, Lund University, S Lund, Sweden [L. H., U. S., H. T.]; Centro Nacional de Condiciones de Trabajo, Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo, ES Barcelona, Spain [A. H. M.]; Dipartimento di Medicina del Lavoro, Clinica del Lavoro Luigi Devoto, Milan University, I Milan, Italy [A. F.]; Finnish Institute of Occupational Health, FIN Helsinki, Finland [P. H., H. N.]; Department of Occupational and Evironmental Medicine, Telemark Central Hospital, N-3710 Skien, Norway [S. W., I-L. H.]; and Danish National Institute of Occupational Health, DK-2100 Copenhagen, Denmark [P. W., L. E. K.] Cancer Res 2000

154 GSTM1 ß GLOBIN GSTT1

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157 Finally, increased aromatic-DNA adducts in subjects with low DNA capacity repair (genes XRCC1, XPD and XRCC3). Matullo et al., 2003

158 VALUTAZIONE DELLESPOSIZIONE TENDENTE A ZERO O AL VALORE DI RIFERIMENTO DELLA POPOLAZIONE GENERALE: LESEMPIO DELL1-PIRENOLO URINARIO

159 VALUTAZIONE DELLESPOSIZIONE PROFESSIONALE MEDIANTE LANALISI DEL 1- PIRENOLO URINARIO NEI SOGGETTI NON FUMATORI QUESTIONARIO CALCOLO DELLINTRODUZIONE DI PIRENE CON LA DIETA TEMPO DI RACCOLTA CAMPIONE URINA Esami da eseguire nel campione urina CREATINURIA ANALISI DELLA NICOTINA E SUOI METABOLITI

160 QUESTIONARIO N. Scheda Data ora Cognome Nome Età OCCUPAZIONE ATTUALE o HOBBIES (attenzione gas di scarico, fumi diesel, olii minerali, pece e catrame) SI/NO ESPOSIZIONE AMBIENTALE residenza citta o campagna luoghi di intenso traffico veicolare SI NO FUMO PASSIVO è stato nelle 48 h precedenti il prelievo di urina in ambienti in cui vi era forte presenza di fumo di tabacco?SI NO se SI specificare il tempo di esposizione in ore FARMACI Uso di pomate dermatologiche, shampoo ecc. (a base di catrame di carbone).....SI NO Specificare il tipo e % di catrame

161 Cena del giorno precedente raccolta urine alle ore Indicare il cibo e quantita(gr.) ingerita 1°piatto °.piatto (se a base di carne specificare il tipo di carne (maiale, manzo, hamburger ecc.), modalita di cottura (stufato, bollito, alla piastra, alla griglia) se tanto o poco cotto contorno frutta dolci bevande(n.bicchieri) caffe, tè, (n.tazzine) Altro fuori pasto alle ore Colazione del giorno raccolta urine alle ore Indicare il cibo e la quantita ingerita(gr.) Bevande (tè, caffe, ecc.; n. di tazze) cibo (pane tostato, uova, pancetta, affettati ecc.) Pranzo del giorno raccolta urine alle ore Indicare il cibo e quantita(gr.) ingerita 1°piatto °.piatto(se a base di carne specificare il tipo di carne (maiale, manzo, hamburger ecc.), modalita di cottura (stufato, bollito, alla piastra, alla griglia) se tanto o poco cotto contorno frutta dolci bevande(n.bicchieri) caffe, tè (n.tazzine) Altro fuori pasto alle ore VALUTAZIONE INTAKE DI PIRENE CON LA DIETA IN Soggetti NON FUMATORI di controllo. QUESTIONARIO

162 Lijinsky (1991); Lo and Sandi (1978) Lijinsky (1991) Lijinsky (1991); Lo and Sandi (1978) Lijinsky (1991) Lo and Sandi (1978); Vaessen et al. (1978) Lo and Sandi (1978) Roggi et al. (1996) LAC (1986) Speer et al. (1990); Vaessen et al., (1988) LAC (1986) Speer et al. (1990) Speer et al. (1990); Roggi et al. (1996) Speer et al. (1990) Roggi et al. (1996) LAC (1986) Lijinsky (1991); Lo and Sandi (1978) Lo and Sandi (1978) Roggi et al. (1996) LAC (1986) Dennis et al.(1991); Vaessen et al.(1988) Roggi et al., (1996) < ;1.3 < Costicine di maiale arrostite Hamburger arrostito Maiale arrostito Salsicce arrostite Manzo arrosto Prosciutto affumicato Manzo affumicato (strisce) Maiale affumicato Carne bollita Carne alla griglia Carne ai ferri Carni fritte Carni affumicate Salumi Campioni di dieta totale (Olanda) (carne stufata) Spinaci Verza Pomodoro Scarola indivia Cavolfiore Insalata Carote Verdure cotte Verdure crude Minestrone Patate, purea Patate fritte Campioni di dieta totale(Olanda) (rimanenti vegetali) Pesce affumicato Arringa non affumicata Salmone non affumicato Pesce fritto Pesce alla griglia Molluschi Campioni di dieta totale (Olanda) (tonno ecc.) Carne Verdura Pesce Riferimento bibliograficoPirene (µg/kg)Prodotto

163 Roggi et al., (1996) Dennis et al.(1991) Dennis et al.(1991); Vaessen et al.(1988) Dennis et al.(1991) Roggi et al., (1996) Dennis et al.(1991) LAC (1986) Roggi et al. (1996) Lijinsky (1991); Lo and Sandi (1978) Roggi et al. (1996) Dennis et al.(1991); Roggi et al., (1996) IARC (1991); Roggi et al. (1996) Roggi et al. (1996) LAC (1986); Roggi et al. (1996) Dennis et al.(1991) Roggi et al. (1996) Dennis et al.(1991) LAC (1986); Roggi et al. (1996) Roggi et al. (1996) ; ;0.01 trascurabile;0.5 trascurabile; ; ; Pane Pane fresco Pane tostato Primi piatti Pizza Crusca Margarina Olio vegetale Burro Maionese Frutta secca Campioni di dieta totale (Olanda) Campione di dieta totale (Italia) Pollo Uova Birra Whisky/liquori Caffe Tè Bevande zuccherine Latte Formaggio Formaggio stagionato Formaggio fresco Yogurt/gelato Crema Surrogati di crema Cioccolata Budino Torte e Biscotti Caramelle Cereali Olio, condimenti Frutta Pollame Bevande Latticini Dolci

164 CONCENTRAZIONE DI PIRENE E DI BAP NEGLI ALIMENTI 0.5Bevande 2323 torte, biscotti cioccolata Dolci 0.8formaggi latteLatticini secca fresca Frutta 1.6olio, margarina, maionesecondimenti pane pasta toast, pane tostato pizza al forno a legna Cereali Tutte fritte Verdure 3Salumi 3-1pesce, carni, polloCarni bollite stufate 2uova 6pesce, carni, polliCani fritte 13pesce, carni, insaccatiCarni affumicate 23pesce 45manzo maiale polloCarni alla griglia 42-23Costicine salsicce maiale 10Bistecca, hamburgher, pollo manzoCarni arrostite Pirene (µg/kg)ProdottoGruppo principale

165 Pirene introdotto (µg) = (CpirXquantita X 50% pranzo) + (CpirXquantitaX 25%colazione)+ (CpirXquantita X 3% cena) CALCOLO DELLINTRODUZIONE DI PIRENE CON LA DIETA emivita pirene dieta è 4 ore

166 TEMPO DI RACCOLTA CAMPIONE URINA almeno dopo tre giorni lavorativi fine turno circa 50 ml tenere al buio ESAMI DA ESEGUIRE NEL CAMPIONE URINA creatinuria analisi della nicotina e/o suoi metaboliti

167 VALORI DI RIFERIMENTO DEI NON- FUMATORI LIMITE DI ATTENZIONE (LA): 0.67µmoli/mole di creatinina (99° percentile dei nostri dati). VALORE LIMITE DI PRUDENZA (LP): 1.40 µmoli/mole di creatinina (Buchet e coll., 1995) VALORE LIMITE DI SOGLIA (LS): 2.30 µmoli/mole di creatinina (Jongeneelen e coll., 1992)

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169 Valutazione del rischio sulla base dei livelli urinari di 1-pirenolo in ambienti di lavoro con esposizione ad IPA SI 3 NOSI 2 NOSI1 NO LS 1.40 LP > 0.67 LA Valore dell indicatore biologicoLivello di rischio

170 Valutazione del rischio sulla base dei livelli urinari di 1-pirenolo in ambienti di lavoro con esposizione ad IPA Spazzacamini; Cokeria forniMonitoraggio biologico approfondito dellesposizione e del danno genotossico.Studio della suscettibilità individuale. Urgente riduzione dellesposizione 3SI Monitoraggio biologico approfondito dellesposizione. 2NOSI Asfaltisti; Anodi; Cokeria altriControllo periodico dell1-pirenolo urinario 1NOSI Oli combustibili A e B; Oli usati; Gomma Nessun intervento.0NO 2.30 LS 1.40 LP > 0.67 LA Gruppi lavorativi di questo studio Interventi propostiLivello di rischioValore dell indicatore biologico

171 Assumendo che il 90% dei PAH dellaria è associato con le particelle respirabili Che l80% dellinalato è depositato nei polmoni Si calcola una media di 0.8 m3/h di aria inspirata Si calcola che per 5 ore di lavoro vi sia un intake di 10.4 ng di pirene pari ad 1/5 dellintake di pirene con la una sigaretta che si stima pari a 50ng. ESEMPIO DI GENOVA 90% X 80%X 0.8 X 3.6 ng/m 3 X 5 ORE =10.4 ng di pirene Calcolo intake di pirene per via inalatoria Merlo et al., 1998

172 METODO ANALISI ADDOTTI-DNA QUESTIONARIO VALUTAZIONE ESPOSIZIONE MEDIANTE QUESTIONARIO RACCOLTA CAMPIONE SANGUE ANALISI ADDOTTO GENOTIPIZZAZIONE?

173 QUESTIONARIO CODICE Unità Operativa/Soggetto |__|__|__|__| (composto da una lettera che identifica la UO: C=Cagliari, B= Bari, seguita da un numero di tre cifre) Data Intervista: |__|__|/|__|__|/|__|__|__|__| Ora inizio intervista |__|__|.|__|__| Cognome _______________________________ Nome _________________________ Data di nascita |__|__|/|__|__|/|__|__|__|__| Comune di nascita __________________________________________ Provincia |__|__| Indirizzo attuale Via ______________________________________ n____________ CAP ____________ Città _________________________________ Provincia |__|__|Tel__________________ Sesso: M FAltezza (cm) |__|__|__|Peso (kg) |__|__|__| Stato civile Coniugato Separato Celibe/nubile Vedovo/a Convivente Istruzione Qual è il suo titolo di studio? (barrare una sola casella) Nessuno Scuola elementare Scuola Media Inferiore Liceo, Scuola superiore Laurea Altro, specificare _________________________________________________________

174 ESPOSIZIONE NELLA ABITAZIONE In quale zona abita? centro città periferia zona extra urbana/rurale Come giudica il traffico nella zona dove si trova la sua abitazione? Traffico intenso continuo per buona parte del giorno Traffico intenso intermittente (ad es. solo nelle ore di punta) Traffico moderato Traffico scarso o assente La sua abitazione è vicina ad insediamenti industriali SI NO se SI, quale tipo di industria?_____________________________________________ A che piano abita? ________ Se abita in citt à, il riscaldamento delle abitazioni vicine alla sua casa è prevalentemente a legna carbone gasolio gas Il riscaldamento della sua abitazione è a legna carbone gasolio gas Centralizzato Autonomo con termosifoni Riscaldamendo con stufese Si, indicare numero di stufe |__|__|__| Altro tipo di riscaldamento: descrivere_____________________________________________________________ Ha il caminetto in casa ? SI NO se SI indicare numero di caminetti |__|__|__| se SI, nell ultimo anno quante volte ha usato il caminetto sia per riscaldare che per cucinare? SettimanaMese Anno Mai o|__|__| o |__|__|__| o |__|__|

175 Che tipo di combustibile ha usato? legna carbonella altro se Altro, specificare: _______________________________________ Quando l ha utilizzato l ultima volta? Data |__|__|/|__|__|/|__|__|__|__| ora |__|__|.|__|__|

176 ESPOSIZIONE AMBIENTALE (EXTRAPROFESSIONALE) LAVORI A DOMICILIO (HOBBIES) con esposizione a oli minerali, catrame, fuliggine, fumi da combustione di legna, foglie o altro materiale combustibile, gas di scarico di motori Nellultimo anno Indicare approssimativamente quante volte: Alla settimana Al mese |__|__|o |__|__| Specificare il tipo di esposizione _____________________________________________

177 Facendo riferimento allultimo anno, può indicare la frequenza con cui ABITUALMENTE mangia i seguenti alimenti? (Pensi sia al pranzo che alla cena) N. volte N. volte N. volte MAI settimana mese anno CIBI FRITTI (CARNE, PESCE, ETC) |__|__| o |__|__| o |__|__| o CIBI ALLA GRIGLIA a |__|__| o |__|__| o |__|__| o CIBI ALLA PIASTRA b |__|__| o |__|__| o |__|__| o PANE TOSTATO |__|__| o |__|__| o |__|__| o PIZZA COTTA A LEGNA |__|__| o |__|__| o |__|__| o CIBI AFFUMICATI |__|__| o |__|__| o |__|__| o MOLLUSCHI |__|__| o |__|__| o |__|__| o VERDURA FOGLIA LARGA VERDE |__|__| o |__|__| o |__|__| o (cavolo, verza, lattuga, e altre insalate, spinaci) ___________________________________________________________________________ ______ a Griglia con legna o carbonella, NO ELETTRICA! b Piastra ad esempio bistecchiera o altra superficie rovente

178 Quali delle seguenti bevande consuma abitualmente e con che frequenze? (Barrare una sola casella per ciascun tipo di bevanda, indicando numero di bicchieri, tazzine al giorno o alla settimana). |__|__||__|TE |__|__||__|CAFFE (TAZZINE) |__|__||__|SUPERALCOLICI |__|__||__|BIRRA (BOCCALI) |__|__||__|VINO (BICCHIERI) Occasionalmente / Maialla settimanaal giornoBEVANDA

179 1) Ha mai fumato sigarette in modo continuativo nella sua vita? SI NO se NO, passare alla domanda 16) 2) A che età ha iniziato a fumare sigarette? |__|__| anni 3) Attualmente fuma sigarette? SI NO se NO, passare alla domanda 14) Se attualmente fuma: 4) Quante sigarette fuma al giorno? |__|__| al giorno 5) Quale marca (marche) di sigarette fuma abitualmente? ___________________________________________________________ 6) Con filtro? SI NO 7) Fuma sigarette fatte a mano? SI NO se NO, passare alla 10) 8) Se SI, quante |__|__| Giorno |__|__| settimana 9) Che marca di tabacco usa? 13) Normalmente aspira il fumo? |__| molto |__| poco|__| per niente Se è un ex-fumatore di sigarette: 14) A quale età ha smesso di fumare? |__|__| anni 15) Quante sigarette al giorno fumava?|__|__| al giorno FUMO DI SIGARETTA

180 SIGARI 16) In tutta la sua vita ha mai fumato 50 sigari? SI NO se NO, passare alla 26) 17) A che et à ha iniziato a fumare sigari? |__|__| anni 18) Attualmente fuma sigari? SI se SI, vai alla 19) NO se NO, passare alla 24) Se attualmente fuma sigari: 19) Quanti sigari fuma al giorno o alla settimana?|__|__| al giorno |__|__| settimana 20) Quale marca (marche) di sigari fuma abitualmente? Se è un ex-fumatore sigari: 24) A quale et à ha smesso di fumare? |__|__| anni 25) Quanti sigari al giorno/settimana fumava?|__|__| al giorno |__|__| settimana PIPA 26) In tutta la sua vita ha mai fumato 35 cariche di pipa? SI NO se NO, vai a 36) 27) A che et à ha iniziato a fumare pipa? |__|__| anni 28) Attualmente fuma la pipa? SI se SI, vai alla 29) NO se NO, vai alla 34) Se attualmente fuma PIPA: 29) Quanti grammi di tabacco fuma in media al giorno o alla settimana? |__|__|__| al giorno __|__|__| settimana 30) Quale marca (marche) di tabacco usa abitualmente? ___________________________________________________________ Se è un ex-fumatore di PIPA: 34) A quale et à ha smesso di fumare? |__|__| anni 35) Quante sigarette al giorno fumava?|__|__| al giorno

181 FUMO PASSIVO 36) Condivide abitualmente spazi/ambienti chiusi (es. ufficio, casa, bar, ecc.) con persone che fumano? SI NO 37) Se SI, per quante ore al giorno circa?|__|__| ore 38) Qualcuno dei conviventi e fumatore SI NO 39) Se SI, quanti? |__|__| ì

182 FARMACI Usa pomate, saponi, shampoo o altri preparati dermatologici al catrame? SI NO Se SI, specificare ___________________________________________________ Negli ultimi 6 mesi ha assunto farmaci in modo regolare ? SI NO Se SI, può indicarmi quali farmaci, per che patologia e il dosaggio? DosePatologiaFarmaco

183 CONCLUSIONE ORA FINE INTERVISTA |__|__|.|__|__| INTERVISTATORE: COGNOME ____________________________________________________________________ NOME ____________________________________________________________________

184 Fumo di tabacco no. sigarette /giorno fumatore attuale che non abbia smesso di fumare un mese prima la raccolta sangue Dieta consumo di carne alla brace grilled o pizza cotta forno a legna almeno una volta alla settimana Esposizione outdoor a traffico autoveicolare almeno 4 ore al giorno Esposizione indoor presenza di caminetti o stufa a legna o carbone hobbies con esposizione da IPA esposizione a fumo passivo Residenza (urbana e rurale)) Traffico intorno alla residenza (intenso o moderato/nullo) Stima dellesposizione ad IPA mediante questionario per lanalisi delladdotto anti-BPDE-DNA

185 Vacutainers con K 3 EDTA ml sangue in 3 vacutainers con K3EDTA isolamento linfomonociti entro 5 ore isolamento e quantificazione DNA analisi addotto in HPLC-fluorescenza metodi DN A Buffy coat

186 VALUTAZIONE DEL LIVELLO DI ADDOTTI NEI LINFOMONOCITI?

187 98(92)**4.10± ± Lavoratori Forni coke POLACCA 69(9)** Lavoratori Forni coke ITALIANA 25(10) * 11(4) 11(3) % (N) di soggetti 95° percentile Spazzacamini Lavoratori anodi alluminio Controlli X DS N Anti-BPDE-DNA (addotti/10 8 nucleotidi) Esposizione ad IPA (1-pirenolo moli/mole creatinina) SoggettiGruppo ANTI-BPDE-DNA NELLE CELLULE MONONUCLEATE DI 115 SOGGETTI ESPOSTI AD IPA

188 AD ALTE ESPOSIZIONI LEFFETTO DI FUMO E DIETA VIENE CANCELLATO

189 Table 2 Anti-B[a]PDE-DNA levels in subjects exposed to PAHs. 189(40) 59(52)* ND ND ± ±1.69** 471(81) 114(19) Outdoor < 4hours 4hours 130(44) 118(41) ND ND ± ± (51) 289(49) Traffic near house Moderate/null intense 137(39) 54(48) 48(45) 9(60)* ND-16.2 ND ND ND ± ± ± ± (60) 113(19) 106(18) 15(3) Indoor Not exposed Low Medium High 77(46) 171(41) ND ND ± ± (29) 417(71) Area of residence Rural Urban /Suburban 122(34) 126(57)** ND ND ± ±2.73** 362(62) 223(38) Diet < (36) 85(66)** ND ND ± ±3.68** 457( 78) 128( 22) Current smoking habits Non-smokers Smokers 248(42)ND ± (100)All N(%)Range b AM±SD a N(%) Positive c Anti-B[a]PDE-DNA (adducts/ 10 8 nucleotides) Anti-BaPDE-DNA nellesposizione ambientale ad IPA

190 Multiple linear regression analysis of influence of histidine content, inoculum size and exposure to mutagens on urinary mutagenicity (ln rev/ml) in non smokers (n=283) Outdoor Traffic near house Area of residence Indoor exposure Diet Concentration of urine (Creatinine (µmoli/L) Inoculum size (number overnight bacteria 10 9 ) Histidine content (µmoli/ 25 ml equivalent urine) %partial r 2 ptb ° The coefficients of regression (b), the test t of partial significance, and the partial explained variance (r 2 ) were estimated for each term included in the model. F=2.439, p=0.011.

191 Determination of DNAs of PAHs has been considered a suitable way of estimating the systemic internal dose to humans. There are still problems with regard to the sensitivity, specificity, and the stability of different adducts that render such methods less suitable at present for use in routine biological monitoring. Determination of hydroxylated metabolites in urine, derived from pyrene and phenanthrene, can be used for monitoring exposure to environmental PAHs. Overall conclusions of biomonitoring PAHs exposure in humans

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195 yyyoooooooooooooooooo o

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198 MINERAL OIL FINISHING PROCESSES VIRGIN LUBE OILS: a) WITH SULFURIC ACID b) WITH HYDROGEN (MILD OR SEVERE TREATMENT) c) WITH SOLVENT RE-REFINED OILS d) WITH CLAY AT HIGH TEMPERATURE e) WITH CLAY AND SULFURIC ACID f) WITH HYDROGEN (MILD OR SEVERE TREATMENT) g) WITH SOLVENT

199 LIGHT MEDIUM HEAVY FRACTION DISTILLATE DISTILLATE °C °C °C DISTILLATION FRACTIONS OF RE-REFINED OILS

200 DISTRIBUTION OF CARCINOGENS IN PETROLEUM RESIDUUM ACCORDING TO DISTILLATION TEMPERATURE (TYE et al. 1966) FRACTION END-POINT % CANCEROGENIC POLYNUCLEAR DISTILLATION °C ACTIVITY COMPOUNDS 1,2, RINGS ,6, RINGS 8, > > 5 RINGS

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208 RATIONALE OF HEALTH & SAFETY STANDARDS (HSS) FOR MINERAL OILS MAXIMUM REDUCTION OF PAH CONTENT IN OILS MEASURED AS ? BUT WHAT DOES A SAFE PAH CONTENT MEAN ? NOT CARCINOGENIC FOR HUMANS?

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213 MOUSE SKIN CARCINOGENICITY PREDICTABILITY* OF MODIFIED AMES TEST AND PAC METHOD IP346/92 PREDICTION M.I. PAF % __________________________________________________________________________ STANDARD __________________________________________________________________________ CORRECT POSITIVE CORRECT NEGATIVE FALSE POSITIVE FALSE NEGATIVE __________________________________________________________________________ *MOBIL DATA-BASE: 60 OILS, ALL EXCEPT ONE VIRGIN OILS; BETTER PREDICTIONS ARE IN BOLD AND UNDERLINED

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215 IARC HYDROTREATED OILS, PRINCIPALLY PARAFFINIC IN NATURE, INDUCE A MODERATE INCIDENCE OF SKIN TUMORS WHEN TREATMENT OF DISTILLATE WAS MILD, WHILE NO TUMOR WAS INDUCED BY SEVERELY HYDROTREATED OILS THERE IS SUFFICIENT EVIDENCE THAT MILDLY HYDROTREATED OILS ARE CARCINOGENIC TO EXPERIMENTAL ANIMALS....AND THERE IS SUFFICIENT EVIDENCE FOR ONE SAMPLE OF USED GASOLINE-ENGINE OIL OSHA AN OIL IS SEVERELY HYDROTREATED IF IT HAS BEEN PROCESSED AT A PRESSURE OF 800 PSI (56 BAR) AND AT A TEMPERATURE OF 800°F (427 °C)

216 GENOTOXICOLOGY OF RECYCLED OILS. A COMPARISON WITH VIRGIN OILS

217 USED OILS FROM SEVERAL SOURCES AUTOMOTIVE ENGINES (CARBURETTOR, INJECTION, DIESEL) INDUSTRIAL PROCESSES (METAL-WORKING, METAL TREATMENT, ROLLING OILS, HYDRAULIC AND GEAR OILS, CUTTING OILS, ETC.)

218 RECOVERED OILS (ITALY 2003) CONSUMPTION RECOVERY % AUTOMOTIVE 320,900 TONS 116,100 TONS 45 INDUSTRY 259,400 TONS 84,200 TONS 26 TOTAL OIL RECOVERED IN ,300 TONS OF WHICH 58% OF AUTOMOTIVE ORIGIN

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229 MEAN VALUES OF MUTAGENICITYAND PAF OF RE-REFINED OILS* BEFORE AND AFTER SEVERE HYDROTREATMENT (FROM DICKSON ET AL., 1997* AND CLONFERO & BLACKBURN, UNPUBLISHED) _____________________________________________________ SAMPLE M.I. PAF% _____________________________________________________ FEEDSTOCK LIGHT* HEAVY* RE-REFINED LIGHT* HEAVY* LIGHT A MEDIUM A HEAVY A LIGHT B MEDIUM B HEAVY B _____________________________________________________ * US PRODUCER, A and B, EUROPEAN PRODUCERS

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