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2 come separare questi oggetti lana pietra cotone lana lana cotone pietra lana pietra cotone pietra cotone cotone lana pietra Forma Grandezza Densità forma Densità grandezza Diversa grandezza Differente sedimentazione Differente velocità di rotolamento Juang RH (2004) BCbasics

3 Basic Principles of Protein Purification Ammonium sulfate fractionation Cell Organelle Homogenization Macromolecule Nucleic acid Carbohydrate (Lipid) SizeChargePolarityAffinity Small molecule Cell Debris Protein Amino acid, Sugar, Nucleotides, etc Gel filtration, SDS-PAGE, Ultrafiltration Ion exchange, Chromatofocusing, Disc-PAGE, Isoelectric focusing Reverse phase chromatography, HIC, Salting-out Affinity chromatography, Hydroxyapatite Juang RH (2004) BCbasics

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5 Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico RIVELATORE colonna pompa Collettore di frazioni Soluzione di eluizione

6 Scambio ionico: separazione in funzione della carica

7 Importanza del pI -A pH > pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e si lega a una resina a scambio anionico ( SCAMBIO ANIONICO ). -A pH < pI (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e si lega a una resina a scambio cationico ( SCAMBIO CATIONICO ).

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11 Eluizione: -Variazione di pH -Variazione forza ionica -ioni competitivi Scambiatrice di anioni: -pH decrescente -forza ionica crescente -anioni competitivi Scambiatrice di cationi: -pH crescente -forza ionica crescente -cationi competitivi

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13 Cromatografia di scambio ionico VANTAGGI –Per grandi volumi, –Grandi quantità di proteina (1-5 g proteina per 100 ml), –Matrice molto robusta, –Condizioni molto flessibili, possibili molte variazioni. SVANTAGGI –Proteine allo stesso pH e concentrazioni di sali della colonna. –Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali.

14 GEL FILTRAZIONE

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19 Gel filtrazione

20 Una proteina sconosciuta eluisce a 170 mL: 40,000 Da (40KDa)

21 Cromatografia di affinità Resina Braccio spaziatore Ligando

22 Cromatografia di affinità Un ligando ad alta affinità per la proteina è legato alla matrice La proteina di interesse si lega al ligando e viene immobilizzata sulla colonna Le altre proteine vengono lavate via. La proteina di interesse viene eluita usando una soluzione di ligando.

23 Cromatografia di affinità VANTAGGI Alta affinità, costanti di dissociazione nellordine del mM, nM o anche pM. Legame tutto o nulla: Possibili molte variazioni (affinity tags) SVANTAGGI Lingombro sterico spesso abbassa la capacità Il braccio spaziatore può avere influenza sul legame Leluizione può richiedere un eluente specifico

24 Affinity tags Gli affinity tags sono si ottengono attraverso la preparazione di proteine ricombinanti. Alla proteina di interesse è legato un tag che presenta affinità con un ligando: TAG –GST –MBP –biotina –Poli-His –Proteina A LIGANDO –Glutatione –Maltosio –Avidina –Nichel, Zinco –Anticorpi Le proteine contenenti affinity tags sono poi isolati per cromatografia di affinità con i ligandi legati alla colonna. Le proteine isolate possono poi venire primate degli affinity tag attraverso proteolisi specifica.

25 Cromatografia di affinità con anticorpi

26 Matrici attivate per immobilizzare uno specifico ligando

27 Protocollo generale di purificazione proteine

28 Obiettivi: Cattura –Isolare, concentrare e stabilizzare la proteina bersaglio Purificazione intermedia –Eliminare la maggior parte dei contaminanti Polishing –Ottenere la massima purezza possibile

29 CONTROLLO DELLO STATO DI PURIFICAZIONE MEDIANTE ELETTROFORESI

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31 Gas cromatografia (Cromatografia di ripartizione gas-liquido)

32 Schema a blocchi di un gascromatografo

33 Esempio – separazione gas- cromatografica di urina di paziente con elevata aciduria


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