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Variazioni epigenetiche Imprinting; Inattivazione cromosoma X (lyonizzazione); Effetto posizione. Inattivazione centromerica (eterocromatina); Modifiche.

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1 Variazioni epigenetiche Imprinting; Inattivazione cromosoma X (lyonizzazione); Effetto posizione. Inattivazione centromerica (eterocromatina); Modifiche ereditabili, che può riguardare un cromosoma o lattività di un gene, che non varia la sequenza nucleotidica.

2 Limprinting genomico consiste nella espressione allelica differenziale e parentale- specifica. Cromosoma materno gene X trascrizionalmente attivo Cromosoma paterno geneX trascrizionalmente inattivo

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4 Caratteristiche principali della seq. di DNA dei geni imprinted: % elevata di CpG islands (bersaglio della metilazione); Sequenze ripetute vicino alle CpG islands; Legame parentale-specifico di particolari complessi proteici responsabili delle modifiche epigenetiche; ImprintingControlRegions in alcuni clusters di geni imprinted.

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6 Altre caratteristiche epigenetiche delle regioni imprinted: Differenze nella frequenza della ricombinazione meiotica vicino o internamente ai clusters imprinted; Asincronia nella fase S del ciclo cellulare; Non si conosce ancora la relazione tra queste caratteristiche ed il grado di metilazione o la struttura della cromatina.

7 Metilazione differenziale degli alleli parentali (DMRs) La metilazione influisce sul grado di espressione genica in modo variabile: la metilazione può riguardare la copia inattiva o attiva del gene (es. gene Igf2).

8 CpG Metilazione Allele 1 (espresso) Allele 2 (a) Promoter methylation MDBs?

9 CpG Igf2r CpG Air Allele materno (espresso) Allele paterno (b) Antisense transcripts

10 (c): Silencing factors CpG of Igf2 Allele paterno (espresso) Allele materno Repressore Metilazione

11 Fattori coinvolti DNA cytosine methyltransferases (Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b); Methyl-CpG-binding proteins (MECP2); Histone-modification enzymes (H3-K4 methyltransferases, H3-K9 methyltransferases), Histone acetyltransferase enzymes (GCN5/PCAF); ATP-dependent remodelling complexes (ISWI);

12 Alcuni geni sottoposti ad imprinting Chr1 (p73); Chr5 (U2AFBPL); Chr6 (MAS1; M6P/IGF2R..); Chr7 (GAMMA2-COP..); Chr11 (H19;IGF2;INS..); Chr13 ( HTR2A); Chr14 (MEG3/GTL2); Chr15 (GABRA5;GABRB3;NDN;PAR1;PAR5;SNRPN;UBE3A) Chr18 (IMPACT); Chr19 ( PEG3); Chr20 (GNAS1;NEURONATIN) ChrX (XIST).

13 Imprinting genomico Cosè limprinting? Meccanismi molecolari responsabili dellimprinting; Regione 15q11-13 e sindromi di PraderWilli- Angelman; Modifiche epigenetiche nella regione critica 15q11- q13.

14 Geni espressi paternamente: SNRPN locus (snoRNA cluster), necdina, PAR1, PAR5, PAR7; Geni espressi maternamente: UBE3A; Imprinting nella regione 15q11-q13 (K.O. e studio di mutazioni)

15 SNRPNUBE3A Maturazione mRNA; 10 esoni; SNRPN locus > 460kb; Espressione monoallelica nel cuore (feto) e nel cervello (feto e adulto). Ubiquitina transferasi; 10 esoni; Locus > 60kb; Espressione monoallelica (cervello).

16 Prader-Willi (PWS)/Angelman syndrome (AS) Cromosoma 15q11-q13 (mouse 7C- D1); PWS (MIM ) AS (MIM ) Ritardo mentale; Obesità; Ipotonia muscolare; Ridotta attività fetale; Bassa statura; Ipogonadismo Ritardo mentale; Ritardo motorio; Atassia; Epilessia; Absence of speech; Facies tipica

17 UBE3ASNRPN Modifiche epigenetiche telcen UBE3ASNRPN telcen Angelman syndrome Prader-Willi syndrome

18 ICR (Impriniting Control Region) nella PWS/AS AS-SRO (0,88Kb), 35Kb upstream SNRPN promoter Fig.1a pubblicazione di Perk PWS-SRO (4,3Kb), SNRPN promoter/exon1

19 AS-SRO e PWS-SRO costituiscono un imprinting box che regola lintero dominio 15q11-q13 su entrambi i cromosomi Modifiche epigenetiche allele-specifiche AS-SRO sul chr paterno PWS-SRO sul chr materno UBE3A non espressoSNRPN non espresso

20 Caratteristiche epigenetiche della AS-SRO. Livelli di metilazione allelica A differenza di quanto atteso, i livelli di metilazione della AS- SRO è simile in entrambi gli alleli ER+ Southern blot AS Met

21 Osservazioni: Forse il livello di metilazione della AS-SRO non costituisce un meccanismo chiave nellimprinting;

22 Accessibilità maggiore nel locus materno. Caratteristiche della cromatina AS-SRO: accessibilità alla Dnasi I. Dnasi I

23 Metilazione H3(K4) e acetilazione H3 e H4 maggiori a livello materno Caratteristiche epigenetiche differenziali. ChIP assay

24 Struttura cromatinica più accessibile sul cromosoma materno; Caratteristiche epigenetiche della AS-SRO Metilazione materna H3 (K4) Acetilazione materna H3 e H4 Espressione genica allele-specifica

25 SNURF-SNRPN gene locus PWS-SRO (4,3Kb), SNRPN promoter/exon1 ChIP assay(Ab anti-acetylated H3 e H4 histone) PCR Acetilazione istonica (espressione genica) Prodotto di PCR Cromosoma paterno Deacetilazione istonica Prodotto di PCR Cromosoma materno

26 ChIP assay Lacetilazione istonica H3/H4 è limitata alla regione 5 del locus SNURF- SNRPN CpG island SNRPN

27 Copia attiva del gene Relazione tra acetilazione istonica e metilazione della CpG island del locus SNURF-SNRPN Acetilazione istonica Metilazione Acetilazione istonica Metilazione Copia inattiva del gene (imprinted)

28 ChIP assayAb anti-acetylated H3 e H4 histone M-PCR: amplificazione del DNA non metilato Relazione tra acetilazione istonica e metilazione della CpG island del locus SNURF-SNURP Prodotto di M-PCR Cromosoma paterno Deacetilazione istonica No prodotto di M-PCR Cromosoma materno Acetilazione istonica

29 Relazione tra acetilazione istonica e metilazione della CpG island del locus SNURF-SNURP La copia attiva del gene (paterna) è caratterizzata da acetilazione istonica e metilazione ChIP assay e M-PCR

30 Conclusioni AS-SRO (copia materna, trascrizionalmente attiva) Suscettibilità alla DNAsi I; Acetilazione istonica H3-H4; Metilazione istonica H3(K4); PWS-SRO (copia paterna, trascrizionalmente attiva) Suscettibilità alla DNAsi I; Acetilazione istonica H3-H4; Metilazione istonica H3(K4); Metilazione CpG island. Modifiche epigenetiche che garantiscono lespressione allelica differenziale

31 Esiste uninfluenza della AS-SRO PWS-SRO? La delezione della AS-SRO, esclusivamente a livello materno, è in grado di influenzare lo stato di metilazione della PWS-SRO; ER+Southern blot Met PWS AS

32 Caratteristiche strutturali della cromatina nella PWS- SRO: La delezione materna della AS-SRO rende la PWS-SRO materna accessibile alla Dnasi I Dnase I assay + Southern blot AS

33 Modifiche epigenetiche differenziali della PWS-SRO: La delezione materna della AS-SRO influisce considerevolmente sullla metilazione istonica del locus PWS-SRO, mentre è ininfluente sullacetilazione istonica. ChIP assay

34 La presenza della AS-SRO sul cromosoma materno interviene nei meccanismi di imprinting che agiscono sulla PWS-SRO. Influenza della AS-SRO sulla PWS-SRO Influenza della PWS-SRO sulla AS-SRO Lassenza della PWS-SRO, sia materna che paterna, non influisce: Sul tasso di metilazione della AS-SRO; Sulla suscettibilità della AS-SRO alla DNasiI; Sul tasso di acetilazione istonica a livello della AS- SRO.

35 Dnasi I assay Influenza della PWS-SRO sulla AS-SRO ER+Southern blot ChIP assay

36 Conclusioni La AS-SRO materna ha un ruolo importante nel determinare una struttura cromatinica chiusa della PWS-SRO materna (DNasiI/ChIP). Lattività della AS-SRO sulla PWS-SRO non è lunico meccanismo in grado di sostenere limprinting della PWS-SRO (acetilazione istonica).

37 La AS-SRO probabilmente acquisisce unespressione differenziale prima della PWS-SRO Conclusioni Gli oociti subiscono metilazione differenziale durante la loro maturazione Entrambi i tipi di gameti non presentano metilazione della PWS-SRO


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