Variazioni epigenetiche

Presentazione sul tema: "Variazioni epigenetiche"— Transcript della presentazione:

1 Variazioni epigenetiche
Modifiche ereditabili, che può riguardare un cromosoma o l’attività di un gene, che non varia la sequenza nucleotidica. Imprinting; Inattivazione cromosoma X (lyonizzazione); Inattivazione centromerica (eterocromatina); Effetto posizione.

2 L’imprinting genomico consiste nella espressione allelica differenziale e parentale-specifica.
Cromosoma materno gene ”X” trascrizionalmente attivo Cromosoma paterno gene”X” trascrizionalmente inattivo

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4 Caratteristiche principali della seq. di DNA dei geni “imprinted”:
% elevata di CpG islands (bersaglio della metilazione); Sequenze ripetute vicino alle CpG islands; Legame parentale-specifico di particolari complessi proteici responsabili delle modifiche epigenetiche; ImprintingControlRegions in alcuni clusters di geni “imprinted”.

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6 Altre caratteristiche epigenetiche delle regioni “imprinted”:
Asincronia nella fase S del ciclo cellulare; Differenze nella frequenza della ricombinazione meiotica vicino o internamente ai clusters “imprinted”; Non si conosce ancora la relazione tra queste caratteristiche ed il grado di metilazione o la struttura della cromatina.

7 Metilazione differenziale degli alleli parentali (DMRs)
La metilazione influisce sul grado di espressione genica in modo variabile: la metilazione può riguardare la copia inattiva o attiva del gene (es. gene Igf2).

8 (a) Promoter methylation
Allele 1 (espresso) CpG Allele 2 MDBs? CpG Metilazione (a) Promoter methylation

9 Allele materno (espresso) (b) Antisense transcripts
CpG Igf2r CpG Air Allele materno (espresso) CpG Igf2r CpG Air Allele paterno (b) Antisense transcripts

10 Allele paterno (espresso)
CpG of Igf2 Allele materno CpG of Igf2 Allele paterno (espresso) Repressore Metilazione (c): Silencing factors

11 DNA cytosine methyltransferases (Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b);
Fattori coinvolti DNA cytosine methyltransferases (Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b); Methyl-CpG-binding proteins (MECP2); Histone acetyltransferase enzymes (GCN5/PCAF); ATP-dependent remodelling complexes (ISWI); Histone-modification enzymes (H3-K4 methyltransferases, H3-K9 methyltransferases),

12 Alcuni geni sottoposti ad imprinting
Chr1 (p73); Chr5 (U2AFBPL); Chr6 (MAS1; M6P/IGF2R..); Chr7 (GAMMA2-COP..); Chr11 (H19;IGF2;INS..); Chr13 (HTR2A); Chr14 (MEG3/GTL2); Chr15 (GABRA5;GABRB3;NDN;PAR1;PAR5;SNRPN;UBE3A) Chr18 (IMPACT); Chr19 (PEG3); Chr20 (GNAS1;NEURONATIN) ChrX (XIST).

13 Imprinting genomico Cos’è l’imprinting?
Meccanismi molecolari responsabili dell’imprinting; Regione 15q11-13 e sindromi di PraderWilli-Angelman; Modifiche epigenetiche nella regione critica 15q11-q13.

14 Imprinting nella regione 15q11-q13
Geni espressi paternamente: SNRPN locus (snoRNA cluster), necdina, PAR1, PAR5, PAR7; Geni espressi maternamente: UBE3A; (K.O. e studio di mutazioni)

15 SNRPN UBE3A Maturazione mRNA; 10 esoni; SNRPN locus > 460kb;
Espressione monoallelica nel cuore (feto) e nel cervello (feto e adulto). Ubiquitina transferasi; 10 esoni; Locus > 60kb; Espressione monoallelica (cervello).

16 Prader-Willi (PWS)/Angelman syndrome (AS)
Cromosoma 15q11-q13 (mouse 7C-D1); PWS (MIM ) AS (MIM ) Ritardo mentale; Obesità; Ipotonia muscolare; Ridotta attività fetale; Bassa statura; Ipogonadismo Ritardo mentale; Ritardo motorio; Atassia; Epilessia; “Absence of speech”; Facies tipica

17 Modifiche epigenetiche
UBE3A SNRPN tel cen Angelman syndrome UBE3A SNRPN tel cen Prader-Willi syndrome Modifiche epigenetiche

18 ICR (Impriniting Control Region) nella PWS/AS
PWS-SRO (4,3Kb), SNRPN promoter/exon1 AS-SRO (0,88Kb), 35Kb upstream SNRPN promoter Fig.1a pubblicazione di Perk

19 Modifiche epigenetiche allele-specifiche
AS-SRO e PWS-SRO costituiscono un “imprinting box” che regola l’intero dominio 15q11-q13 su entrambi i cromosomi Modifiche epigenetiche allele-specifiche AS-SRO sul chr paterno PWS-SRO sul chr materno UBE3A non espresso SNRPN non espresso

20 Caratteristiche epigenetiche della AS-SRO
Caratteristiche epigenetiche della AS-SRO. Livelli di metilazione allelica ER+ Southern blot AS AS Met A differenza di quanto atteso, i livelli di metilazione della AS-SRO è simile in entrambi gli alleli

21 Osservazioni: Forse il livello di metilazione della AS-SRO non costituisce un meccanismo chiave nell’imprinting;

22 Caratteristiche della cromatina AS-SRO: accessibilità alla Dnasi I.
Accessibilità maggiore nel locus materno.

23 Caratteristiche epigenetiche differenziali.
Metilazione H3(K4) e acetilazione H3 e H4 maggiori a livello materno ChIP assay

24 Caratteristiche epigenetiche della AS-SRO
Struttura cromatinica più accessibile sul cromosoma materno; Metilazione materna H3 (K4) Acetilazione materna H3 e H4 Espressione genica allele-specifica

25 SNURF-SNRPN gene locus
PWS-SRO (4,3Kb), SNRPN promoter/exon1 ChIP assay (Ab anti-acetylated H3 e H4 histone) PCR Acetilazione istonica (espressione genica) Deacetilazione istonica Prodotto di PCR Prodotto di PCR Cromosoma paterno Cromosoma materno

26 ChIP assay SNRPN L’acetilazione istonica H3/H4 è limitata alla regione 5’ del locus SNURF-SNRPN CpG island

27 Copia inattiva del gene (“imprinted”)
Relazione tra acetilazione istonica e metilazione della CpG island del locus SNURF-SNRPN Copia attiva del gene Copia inattiva del gene (“imprinted”) Acetilazione istonica Acetilazione istonica Metilazione Metilazione

28 Relazione tra acetilazione istonica e metilazione della CpG island del locus SNURF-SNURP
ChIP assay Ab anti-acetylated H3 e H4 histone M-PCR: amplificazione del DNA non metilato Deacetilazione istonica Acetilazione istonica Prodotto di M-PCR No prodotto di M-PCR Cromosoma paterno Cromosoma materno

29 Relazione tra acetilazione istonica e metilazione della CpG island del locus SNURF-SNURP
La copia attiva del gene (paterna) è caratterizzata da acetilazione istonica e metilazione ChIP assay e M-PCR

30 AS-SRO (copia materna, trascrizionalmente attiva)
Conclusioni AS-SRO (copia materna, trascrizionalmente attiva) PWS-SRO (copia paterna, trascrizionalmente attiva) Suscettibilità alla DNAsi I; Acetilazione istonica H3-H4; Metilazione istonica H3(K4); Metilazione CpG island. Suscettibilità alla DNAsi I; Acetilazione istonica H3-H4; Metilazione istonica H3(K4); Modifiche epigenetiche che garantiscono l’espressione allelica differenziale

31 Esiste un’influenza della AS-SRO PWS-SRO?
Met ER+Southern blot La delezione della AS-SRO, esclusivamente a livello materno, è in grado di influenzare lo stato di metilazione della PWS-SRO;

32 Caratteristiche strutturali della cromatina nella PWS-SRO:
La delezione materna della AS-SRO rende la PWS-SRO materna accessibile alla Dnasi I AS Dnase I assay + Southern blot

33 Modifiche epigenetiche differenziali della PWS-SRO:
La delezione materna della AS-SRO influisce considerevolmente sullla metilazione istonica del locus PWS-SRO, mentre è ininfluente sull’acetilazione istonica. ChIP assay

34 Influenza della AS-SRO sulla PWS-SRO
La presenza della AS-SRO sul cromosoma materno interviene nei meccanismi di imprinting che agiscono sulla PWS-SRO. Influenza della PWS-SRO sulla AS-SRO L’assenza della PWS-SRO, sia materna che paterna, non influisce: Sul tasso di metilazione della AS-SRO; Sulla suscettibilità della AS-SRO alla DNasiI; Sul tasso di acetilazione istonica a livello della AS-SRO.

35 Influenza della PWS-SRO sulla AS-SRO
ER+Southern blot Dnasi I assay ChIP assay

36 Conclusioni La AS-SRO materna ha un ruolo importante nel determinare una struttura cromatinica “chiusa” della PWS-SRO materna (DNasiI/ChIP). L’attività della AS-SRO sulla PWS-SRO non è l’unico meccanismo in grado di sostenere l’imprinting della PWS-SRO (acetilazione istonica).

37 Entrambi i tipi di gameti non presentano metilazione della PWS-SRO
Conclusioni La AS-SRO probabilmente acquisisce un’espressione differenziale prima della PWS-SRO Gli oociti subiscono metilazione differenziale durante la loro maturazione Entrambi i tipi di gameti non presentano metilazione della PWS-SRO