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UOC Anatomia Patologica Azienda Ospedaliera - Università degli Studi di Padova Dipartimento di Scienze Statistiche - Università degli Studi di Padova Lattività

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Presentazione sul tema: "UOC Anatomia Patologica Azienda Ospedaliera - Università degli Studi di Padova Dipartimento di Scienze Statistiche - Università degli Studi di Padova Lattività"— Transcript della presentazione:

1 UOC Anatomia Patologica Azienda Ospedaliera - Università degli Studi di Padova Dipartimento di Scienze Statistiche - Università degli Studi di Padova Lattività proliferativa nel carcinoma della mammella: come valutarla? Dott. Enrico Orvieto 4° CONFRONTO INTERISTITUZIONALE IN PATOLOGIA MAMMARIA DA SCREENING Padova novembre 2011

2 Ki-67: Figlio di un Dio minore Viale: SIAPEC Palermo 2011

3 Ki67 immunohistochemistry: a valuable marker in prognostication but with a risk of misclassification: proliferation subgroups formed based on Ki67 immunoreactivity and standardized mitotic index Jalava et al 2006 Valori 15; >16 e 30; >30 discriminavano nelle pazienti endocrino responsive diverse categorie di rischio. Valutazione effettuata su area periferica della neoplasia, con maggior proliferazione, contando 200 cellule St. Gallen 2009

4 Ki67 Index, HER2 Status, and Prognosis of Patients With Luminal B Breast Cancer Maggie C. U. Cheang et al. J Natl Cancer Inst Nei 144 casi identificati come luminal (dalla metodica molecolare) si è individuato il cut-off del Ki67 (14%) in grado di separare i casi luminal A dai luminal B 357 tumori della mammella studiati con gene expression profiles (50-gene PAM50) La distinzione tra Luminal A e B avviene prevalentemente sulla base dellespressione di geni coinvolti nella proliferazione Lespressione IHC di ER, PgR, HER2 e di Ki67 (cut-off 14%), è stata utilizzata come surrogato alla classificazione molecolare dei Luminal in una casistica di oltre 4000 casi St. Gallen 2011

5 Ki67 Index, HER2 Status, and Prognosis of Patients With Luminal B Breast Cancer Cheang et al 2009 Un core di 0,6 mm selezionato casualmente nel tessuto neoplastico Percentuale di cellule positive sul totale delle cellule neoplastiche

6 This study has several limitations. The main weaknesses of immunohistochemical approaches are limited technical reproducibility, subjective interpretation, and qualitative readouts. To facilitate analysis of suffi ciently large cohorts of samples, the immunostaining panel was trained and validated on tissue microarrays, whereas clinical implementation would likely occur on whole sections. Cheang et al 2009

7 Eppure… Quantità di dati sul valore prognostico e predittivo di KI-67 A dispetto di: –Uso di diversi materiali (TMA vs core biopsies vs intere sezioni) –Differenti protocolli di colorazione –Differente valutazione dei risultati Possiamo migliorare standardizzazione e riproducibilità? Viale: SIAPEC Palermo 2011

8 Le raccomandazioni internazionali J Natl Cancer Inst 2011; 103: Viale: SIAPEC Palermo 2011

9 Gradiente di Ki-67 Viale: SIAPEC Palermo 2011

10 Gradiente & hot spots Viale: SIAPEC Palermo 2011

11 Gradiente & hot spots ? Viale: SIAPEC Palermo 2011

12 The approach to scoring hot spots varies across studies; some investigators have focused in particular on the analysis of hot spots, others have included hot spots in a general assessment of Ki67 across the section, and yet others have recommended avoiding them altogether. This issue needs clarification, and a working party of the International Ki67 in Breast Cancer Working Group has been established to assess which method is more robust. In the meantime, for the purposes of consistency, when hot spots are present, an approach that assesses the whole section and records the overall average score is recommended. J Natl Cancer Inst 2011; 103:

13 Spot 1: 90% Ki67 Spot 2: 30% Ki67

14 Valore medio tra spot 1 e 2 = 60% ki67 Spot 1: 180 cell Ki67 +/200 cell tumorali = 90% Ki67 Spot 2: 45 cell Ki67 +/150 cell tumorali = 30% Ki67 Somme delle cell positive per ki67 tra i due spot: 225/350 = 64% ki67

15 Cut points for prognosis, prediction, and monitoring should only be applied if the results from local practice have been validated against those in studies that have defined the cutoff for the intended use of the Ki67 result. Data handling A threshold that is appropriate for determination of prognosis may not pertain to one that is used for eligibility for a neoadjuvant trial or for use of Ki67 as a pharmacodynamic marker. Currently, in the absence of harmonized methodology, the International Ki67 in Breast Cancer Working Group was unable, therefore, to come to consensus regarding the ideal cut point(s) that might be used in clinical practice. Recommendations

16 Ki67 TV MIB1 DAKO20G SP6 VENTANA 15 (20) P MIB1 DAKO BONDMAX 9 (20) Z 30-9 VENTANA 40 A SP6 NEOMARKER LEICABOND 15 (20) H 30-9 VENTANA 30 (20) QNP B MIB1 DAKO BONDMAX 20I MIB1 DAKO 10 (20) R SP6 5 (20) C MIB1 DAKO 25L MIB1 DAKO BONDMAX 20S MIB1 DAKO BONDMAX 10 (15) D SP6 NEOMARKER LEICABOND 10 (20) M 30-9 VENTANA 10 (35) T MIB1 DAKO BONDMAX 10 E MIB1 DAKO BONDMAX 8 (20) N 30-9 VENTANA 24U MIB1 DAKO 10 (20) F 30-9 VENTANA 25O 30-9 VENTANA 30V25 Ventana = alto LI; score superiore: pregio o difetto? Necessaria correlazione clinica MIB1 e SP6 sovrapponibili Valutazione: 10 casi basso LI (rosa)

17 Il nostro studio prevedeva di valutare lattività proliferativa con metodica immunoistochimica in 50 casi di carcinoma della mammella Cercando di evidenziare il metodo più corretto ed efficace per valutare lattività proliferativa mediante lespressione di ki67 Confronto tra metodiche di valutazione dellattività proliferativa nel carcinoma della mammella

18 Ki67 colorazioni nella linea cellulare MCF-7. A mitosi; dalla B alla F la fase precoce (G1); Nella G assente; da H a L confinate nei nucleoli. Dalla M alla Q con presenza congiunta nel nucleo e nella matrice nucleare ; R una cellula in profase caratterizzata da condensazione cromosomica

19 Tre regioni del diametro di 3mm ciascuna che sono state evidenziate con inchiostro permanente Queste aree erano selezionate cercando di rappresentare leterogenea espressione dellattività proliferativa della neoplasia.

20 Valutazione con reticolo Reticolo di 10 mm di lato diviso in 100 celle inserito nelloculare del microscopio Per ogni regione vengono contati 3 reticoli

21

22 Analizzatore digitale Valutazione effettuata su ogni regione Lanalizzatore è tarato per valutare un massimo di 350 cellule per area Valutazione routinaria Valutazione in percentuale di cellule proliferanti sul totale delle cellule Vengono valutate approssimativamente 500 cellule per area

23 Significatività differenze (p) Differenza complessiva Valutazione clinica routinaria Vs valutazione routinaria Valutazione clinica routinaria vs Valut Analizzatore digitale Valutazione clinica routinaria Vs Valut con griglia Valutazione clinica routinaria 0,01370,00260,42730,0402 Confronto con dato clinico dellattività proliferativa

24 Percentuali medieSignificatività differenze (p) Valut Analizzatore digitale Valut. routinaria Valut con griglia Differenza complessiva Digitale vs routine Digitale vs griglia Griglia vs routine Percentuale totale 23,023,225,00,0240,7390,0120,029 Media percentuali 3 aree 23,925,724,90,0820,0260,2060,325

25 Percentuali medieSignificatività differenze (p) Valut Analizzatore digitale Valut. routinari a Valut con griglia Differenza complessiva Digitale vs routine Digitale vs griglia Griglia vs routine Grading 1 (% totale) 12,710,410,80,2810,1460,2200,802 Grading 2 (% totale) 15,617,817,60,2740,9040,1870,151 Grading 3 (% totale) 41,943,247,10,0170,2190,0050,091 Grading 1 (media medie) 13,011,410,80,3470,3210,1660,672 Grading 2 (media medie) 16,617,918,20,3510,2780,1700,768 Grading 3 (media medie) 35,439,237,20,0370,0110,2060,172

26 Il confronto tra la valutazione con analizzatore di immagini e la valutazione manuale effettuata con il metodo descritto si è dimostrata significativamente correlata

27 La valutazione di una singola griglia era sufficiente per valutare correttamente lespressione dellattività proliferativa dellintero campo identificato sul vetrino Era necessario esaminare larea con 3 reticoli o si poteva diminuire il numero di reticoli contati? stabilito un livello di precisione si è calcolato quante griglie servono per arrivare alla stima della percentuale giusta col margine d'errore prefissato.

28 Lunità griglia (100 celle contate) era il minimo da contare Il numero medio di cellule contate nelle griglie del nostro studio variava da 180 a 570

29 Per conoscere lattività proliferativa dellintera neoplasia sarebbe necessario suddividere la porzione infiltrante periferica della neoplasia in campi da 3mm di diametro e valutare una singola griglia per campo Valutazione estremamente onerosa in termini di tempo-lettura

30 Selezionato 20 dei 50 casi Selezione è avvenuta in maniera casuale bilanciando i diversi casi in funzione del grading Abbiamo valutato interamente la periferia della neoplasia costruito un algoritmo che individua, facendo tutte le possibili combinazioni casuali di aree, quante aree si devono contare per avere un margine d'errore accettabile.

31 1 area2 aree3 aree4 aree5 aree Errore medio Obbiettivo è quello di individuare il numero minore di aree, selezionate, in maniera casuale, che consentano di raggiungere il valore della conta di tutta larea di proliferazione

32 Quanti campi, selezionati casualmente, sono necessari per ottenere il valore corretto dellattività proliferativa dellintera sezione neoplastica? Considerando una popolazione con differente attività proliferativa, per ottenere il valore dellattività proliferativa più corretto è necessario valutare con il metodo descritto almeno 5 aree.

33 Un errore di valutazione del 10% dellattività proliferativa può avere differente impatto clinico alla luce dei cut off che stanno emergendo dalla letteratura una variazione dal 40% al 44% del valore dellattività proliferativa è dal punto di vista clinico ininfluente una variazione dal 13% al 14,3% del valore dellattività proliferativa può essere discriminante

34 La valutazione dellattività proliferativa con metodica immunoistochimica sembra assumere un significato clinico rilevante Cosa valutare? La massima attività proliferativa della neoplasia? Lattività proliferativa dellintera neoplasia? Quali anticorpi anti ki-67 usare? Metodi automatici o valutazione manuale? Necessaria la standardizzazione della valutazione

35 La valutazione manuale se basata su concetti condivisi e con parametri certi è efficace quanto la valutazione con analizzatori di immagini computerizzati Dal nostro studio emerge che per ottenere una valutazione più corretta dellattività proliferativa è necessario valutare almento 5 regioni selezionate casualmente alla periferia della neoplasia Che per ogni regione è sufficiente contare le cellule incluse nellarea di un reticolo, o in alternativa in unarea equivalente ( mm 2 a 400x) Che il numero di cellule contate è un parametro meno significativo rispetto ad un campionamento appropriato della regione proliferante della neoplasia Conclusioni

36 Le considerazioni espresse vanno comunque validate anche con una riproducibilità interlaboratorio In attesa di ulteriori decisioni delle linee guida In attesa della definizione di cut-off correlati a metodiche standard

37 Dott.ssa Giovanna Boccuzzo Dipartimento di Scienze Statistiche dellUniversità di Padova Prof. Massimo Rugge Dott Marcello Lo Mele Dott.ssa Rajshree Sangapur Dott. Luciano Giacomelli UOC Anatomia Patologica Azienda Ospedaliera – Università di Padova


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