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Applicazioni: 1- la variabilità genetica nelle scienze forensi Le scienze forensi hanno la funzione di aiutare i giudici e le giurie nel prendere delle.

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1 Applicazioni: 1- la variabilità genetica nelle scienze forensi Le scienze forensi hanno la funzione di aiutare i giudici e le giurie nel prendere delle decisioni per risolvere questioni legali, siano esse legate a crimini o controversie civili. La genetica forense è una delle discipline delle scienze forensi. Limportanza della genetica nelle scienze forensi si è notevolmente accresciuta negli ultimi anni, grazie alla evoluzione dei marcatori genetici polimorfici e degli strumenti utilizzati

2 Variabilità genetica nelle scienze forensi A cosa serve? Identificare individui che hanno commesso dei crimini Identificare individui che hanno commesso dei crimini Predire la popolazione di origine di un DNA (es. Africano, Asiatico ecc.) Predire la popolazione di origine di un DNA (es. Africano, Asiatico ecc.) Ottenere informazioni fenotipiche su un soggetto (es. colore capelli) Ottenere informazioni fenotipiche su un soggetto (es. colore capelli) Identificare le vittime nei disastri di massa (disastri aerei, genocidi, ecc.) Identificare le vittime nei disastri di massa (disastri aerei, genocidi, ecc.) Risolvere casi di paternità incerta Risolvere casi di paternità incerta Identificazione di droghe Identificazione di droghe Identificazione di DNA appartenente a specie a rischio di estinzione in crimini legati al loro contrabbando Identificazione di DNA appartenente a specie a rischio di estinzione in crimini legati al loro contrabbando

3 Variabilità genetica nelle scienze forensi Il primo caso: il signor Colin Pitchfork 1983: Lynda Mann, 15 anni, viene violentata e uccisa nel Leichestershire (UK) 1986: Dawn Ashworth, 15 anni, viene violentata e uccisa nella stessa zona Il modus operandi nei due delitti era lo stesso ed il gruppo sanguigno (gruppo A), determinato dalle tracce di liquido seminale, era il medesimo. 1986: Richard Buckland, un ragazzo del posto, venne incriminato dei due delitti, ma lanalisi del DNA mediante fingerprinting rivelò successivamente che egli era innocente. Circa 5000 individui nel Leichestershire possedevano il gruppo sanguigno A. Si organizzò uno screening di massa ed in nessun caso il DNA fingerprinting dei 5000 individui corrispondeva a quello dellassassino. 1987: una persona del posto rivelò che un amico, un certo Colin Pitchford, gli aveva chiesto di partecipare allo screening in sua vece in cambio di denaro. Il signor Pitchfork venne invitato a donare il sangue ed il profilo del suo DNA risultò identico a quello del DNA raccolto sulla scena dei due delitti.

4 Variabilità genetica nelle scienze forensi Il DNA fingerprinting Introdotto da Alec Jeffreys nel 1975 Introdotto da Alec Jeffreys nel 1975 Il DNA viene estratto, digerito con enzimi di restrizione, sottoposto ad elettroforesi, denaturato e trasferito su membrana (southern blotting). Quindi viene utilizzata una sonda multi-locus core minisatellite marcata con radioattivo per libridazione. Il DNA viene estratto, digerito con enzimi di restrizione, sottoposto ad elettroforesi, denaturato e trasferito su membrana (southern blotting). Quindi viene utilizzata una sonda multi-locus core minisatellite marcata con radioattivo per libridazione. Il segnale radioattivo viene rivelato mediante esposizione di una lastra sensibile ai raggi X Il segnale radioattivo viene rivelato mediante esposizione di una lastra sensibile ai raggi X Probabilità di match con sonda multilocus = 3 X

5 Evoluzione dei marcatori utilizzati nella genetica forense Il primo marcatore utilizzato per fini forensi è stato il DNA fingerprinting, basato su sonde multilocus per minisatelliti (Pitchfork) Il primo marcatore utilizzato per fini forensi è stato il DNA fingerprinting, basato su sonde multilocus per minisatelliti (Pitchfork) Vengono introdotte le sonde per singoli loci minisatelliti (SLP), si ha il vantaggio di poter trattare da un punto di vista statistico i dati (probabilità di match) Vengono introdotte le sonde per singoli loci minisatelliti (SLP), si ha il vantaggio di poter trattare da un punto di vista statistico i dati (probabilità di match) Primo kit commerciale per lindividuazione di SNPs tramite PCR (sistema HLA), si ha il vantaggio di poter analizzare frammenti degradati e/o in scarsa quantità Primo kit commerciale per lindividuazione di SNPs tramite PCR (sistema HLA), si ha il vantaggio di poter analizzare frammenti degradati e/o in scarsa quantità Primi anni 90. Vengono utilizzati i microsatelliti: elevata eterozigosità, PCR, vantaggi per la trattazione statistica. Primi anni 90. Vengono utilizzati i microsatelliti: elevata eterozigosità, PCR, vantaggi per la trattazione statistica mtDNA: elevata variabilità di sequenza, tipizzazione possibile anche su quantità minime di DNA mtDNA: elevata variabilità di sequenza, tipizzazione possibile anche su quantità minime di DNA primo STR del cromosoma Y: campioni misti uomo/donna ecc primo STR del cromosoma Y: campioni misti uomo/donna ecc.

6 Marcatori autosomici, del mtDNA e del cromosoma Y: vantaggi e svantaggi nelle scienze forensi

7 Generare un profilo STR 1. Estrarre e purificare il DNA 1. Estrarre e purificare il DNA Contenuto in DNA dei campioni biologici: Tipo di campioneQuantità di DNA Sangue 30,000 ng/mL macchia 1 cm ng macchia 1 mm 2 2 ng Liquido seminale 250,000 ng/mL tampone vaginale postcoitale0 - 3,000 ng Capelli Capello strappato Capello perso ng/capello ng/capello Saliva Urine 5,000 ng/mL ng/mL

8 Primers marcati con fluorocromi differenti per differenti gruppi di STRs Amplificare tramite PCR più microsatelliti (multiplex) utilizzando primers fiancheggianti Amplificare tramite PCR più microsatelliti (multiplex) utilizzando primers fiancheggianti Generare un profilo STR: 2. PCR

9 Generare un profilo STR: 3. sequenziamento mediante elettroforesi capillare: ABI 310

10 Prodotto PCR iniettato nella colonna Prodotto PCR iniettato nella colonna Si applica corrente elettrica Si applica corrente elettrica Il DNA viene separato in base alla sua lunghezza: Il DNA viene separato in base alla sua lunghezza: Il DNA si muove vero il polo positivo Il DNA si muove vero il polo positivo Il colore del prodotto PCR viene registrato quando passa nel detector Il colore del prodotto PCR viene registrato quando passa nel detector Detector Window Generare un profilo STR: 3. seq. mediante elettroforesi capillare:

11 Generare un profilo STR: 4. interpretazione dei dati del sequenziamento: dati grezzi

12 D3vWAFGA D8D21D18 D5D13D7 Am RAW DATA PROCESSED DATA Il software GENESCAN divide I dati grezzi in un elettroferogramma separato per ciascun colore Blue Green Yellow Red Il software GENOTYPER identifica i differenti loci e per ciascuno di essi riconosce gli alleli facendo riferimento ad uno standard di peso molecolare

13 La probabilità di match: la regola del prodotto Il peso di una corrispondenza (match) tra un profilo di DNA ed un sospetto è quantificato tramite la probabilità di match: Il peso di una corrispondenza (match) tra un profilo di DNA ed un sospetto è quantificato tramite la probabilità di match: Ovvero: qualè la probabilità che un profilo come quello creato a partire dal materiale biologico rinvenuto corrisponda ad un individuo della popolazione? Ovvero: qualè la probabilità che un profilo come quello creato a partire dal materiale biologico rinvenuto corrisponda ad un individuo della popolazione? Si applica la regola statistica del prodotto per eventi indipendenti Si applica la regola statistica del prodotto per eventi indipendenti

14 La regola del prodotto 0.222x x2 = 0.1

15 Probabilità di match: la regola del prodotto 1 in 79,531,528,960,000,000 1 in 101 in 1111 in 20 1 in 22,200 xx 1 in 1001 in 141 in 81 1 in 113,400 xx 1 in 1161 in 171 in 16 1 in 31,552 xx

16 Contenuto in DNA dei campioni biologici: Tipo di campioneQuantità di DNA Sangue 30,000 ng/mL macchia 1 cm ng machia 1 mm 2 2 ng Liquido seminale 250,000 ng/mL tampone vaginale postcoitale0 - 3,000 ng Capelli Capello strappato Capello perso ng/capello ng/capello Saliva Urine 5,000 ng/mL ng/mL

17 Il massacro di Srebrenica –Le forze serbe conquistano Srebrenica –Vengono massacrati numerosi Bosniaci mussulmani –Si perdono le tracce di persone

18 Il massacro di Srebrenica Viene raccolto il sangue dei parenti delle persone scomparse Viene raccolto il sangue dei parenti delle persone scomparse Vengono sequenziati la regione di controllo del DNA mitocondriale ed alcuni STR autosomici Vengono sequenziati la regione di controllo del DNA mitocondriale ed alcuni STR autosomici Viene estratto il DNA dai resti delle vittime non identificate Viene estratto il DNA dai resti delle vittime non identificate Viene analizzato il DNA nucleare per I resti meglio conservati ed il mtDNA nei casi più degradati Viene analizzato il DNA nucleare per I resti meglio conservati ed il mtDNA nei casi più degradati Il confronto dei profili del DNA dei parenti con quello delle vittime permette di riconoscere lidentita di numerose vittime Il confronto dei profili del DNA dei parenti con quello delle vittime permette di riconoscere lidentita di numerose vittime

19 Identificazione delle persone disperse nel World trade center in seguito ad attacco terroristico del 9/11 Il progetto ha generato Il progetto ha generato –52,000 profili STR –44,000 profili mtDNA –17,000 profili SNPs 850 delle 1594 vittime identificate grazie allanalisi del DNA 850 delle 1594 vittime identificate grazie allanalisi del DNA

20 Il caso dellalbero testimone 3 maggio 1992, Phoenix, AZ 3 maggio 1992, Phoenix, AZ Una donna viene ritrovata morta per strangolamento nelle vicinanze di alberi di Una donna viene ritrovata morta per strangolamento nelle vicinanze di alberi di Cercidium floridum. Nel camion di un sospetto vengono rinvenuti dei frutti di Cercidium floridum. La specie in questione presenta una notevole variabilità di sequenza La specie in questione presenta una notevole variabilità di sequenza Lanalisi del DNA (mediante analisi RAPD- random amplified polymorphic DNA) permette di stabilire che i frutti appartengono ad uno degli alberi che si trovano sulla scena del delitto Lanalisi del DNA (mediante analisi RAPD- random amplified polymorphic DNA) permette di stabilire che i frutti appartengono ad uno degli alberi che si trovano sulla scena del delitto Il profilo RAPD non corrisponde a nessuno degli alberi della stessa specie analizzati per confronto Il profilo RAPD non corrisponde a nessuno degli alberi della stessa specie analizzati per confronto Il sospetto viene incriminato Il sospetto viene incriminato

21 La tecnica RAPD – Random Amplified Polymorphic DNA Si utilizzano dei primers corti (10 basi) che hanno una elevata probabilità di appaiarsi a più regioni del genoma e quindi producono una serie di amplificati che possono poi essere analizzati mediante separazione su gel di agarosio. Generalmente utilizzati quando non si ha a disposizione la sequenza del DNA di una certa specie, oppure non se ne conoscono siti variabili

22 Il gatto palla di neve 3 ottobre 1994, Prince Edward Island, Canada 3 ottobre 1994, Prince Edward Island, Canada Scompare una donna di 32 anni, successivamente ritrovata morta. Scompare una donna di 32 anni, successivamente ritrovata morta. Nella sua macchina abbandonata vengono ritrovate tracce del suo sangue assieme ai peli di un gatto Nella sua macchina abbandonata vengono ritrovate tracce del suo sangue assieme ai peli di un gatto Lex marito della vittima, tra i sospettati, vive con un gatto di nome palla di neve Lex marito della vittima, tra i sospettati, vive con un gatto di nome palla di neve Il DNA estratto dai peli di palla di neve presenta un profilo DNA uguale a quello ottenuto dai peli ritrovati nella macchina della vittima. Il DNA estratto dai peli di palla di neve presenta un profilo DNA uguale a quello ottenuto dai peli ritrovati nella macchina della vittima. Lex marito viene incriminato Lex marito viene incriminato

23 Problemi per lutilizzazione dei marcatori polimorfici in ambito forense Degradazione Degradazione Drop out allelico Drop out allelico Falsi picchi Falsi picchi Regola del prodotto non sempre valida (parenti) Regola del prodotto non sempre valida (parenti)

24 Problemi: Dropout allelico 1500 Campione da analizzare Campione di riferimento 150 ? Quando il DNA estratto è molto scarso o fortemente degradato si può verificare che uno solo dei due alleli ad un locus venga amplificato. Nella figura lallele 14 al sito D13S317 non si è amplificato: Falso omozigote 8/8, in realtà eterozigote 8/14

25 Problemi: falsi picchi –Negli elettroferogrammi possono presentarsi dei falsi picchi dovuti a problemi tecnici e/o biologici. –Questi picchi possono essere interpretati erroneamente come alleli

26 Problemi: La regola del prodotto non considera la possibilità che il colpevole sia un parente del sospettato Se il colpevole è un parente del sospettato, la regola del prodotto per calcolare la probabilità di match non è più valida, in quanto i due condivideranno diversi alleli uguali per discendenza.


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