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ELABORATO FINALE “Utilizzo della Real Time PCR per analizzare l’ espressione dei geni indotti in fase post diauxica in S. cerevisiae” Candidata: Relatore.

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1 ELABORATO FINALE “Utilizzo della Real Time PCR per analizzare l’ espressione dei geni indotti in fase post diauxica in S. cerevisiae” Candidata: Relatore interno: Fabiana Pasquali Prof. Rodolfo Negri Anno accademico Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali Corso di Laurea triennale in Scienze Biologiche 1

2 2 STRUTTURA ED ULTRASTRUTTURA DELLA CROMATINA Il nucleosoma è l’unità fondamentale della cromatina È composto da: - Un ottamero proteico: un tetramero centrale formato da due istoni H3 e due istoni H4, più Una coppia di dimeri H2A-H2B uno sotto e uno sopra. - Circa 146 pb di DNA avvolgono due volte l’ ottamero proteico cp

3 3 RIMODULAZIONE DELLA CROMATINA E MODIFICAZIONI CHIMICHE DEGLI ISTONI Al fine di consentire l’ espressione genica, è necessario che il DNA sia accessibile all’ RNA polimerasi e ad altre proteine. Ciò è reso possibile grazie a: - Rimodellamento dei nucleosomi - Modificazioni covalenti del DNA e degli istoni (codice istonico)

4 4 Le modificazioni post-traduzionali e il codice istonico - Le modifiche sono apportate da fattori proteici (writers),che possono essere più o meno specifici per un residuo istonico e sono rimosse da altri fattori proteici (erasers). - Le modifiche vengono lette da appositi fattori (readers) H1-H2B H2A-H2B Effetti delle modifiche post traduzionali cis trans

5 5 Metilazione Due le classi principali di HTM : ● le arginine metiltransferasi: metilano le arginine 2, 17 e 26 dell’ istone H3 e l’ arginina 3 dell’ istone H4 ● le lisine metiltransferasi : metilano le lisine con dominio SET: metilano le Lys 4,9,27,36 di H3 e Lys 20 di H4 Senza dominio SET: DOT1 che metila K79 su H3 Il donatore dei gruppi –CH3 è la S-adenosil-metionina (SAM)

6 6 Set1 Sei sono le lisine istoniche metilabili: H3K4, H3K9, H3K27, H3K36, H3K79 e H4K20, di queste, in S.cerevisiae solo tre lo sono. H3K4 ● è presente in tutti e tre gli stati di metilazione ● la metilazione in tutti e tre i casi è catalizzata da SET1 Compass PAF1/ FACT 3’ 5’

7 7 Demetilazione e Jhd2 ● LSD1 : amminossidasi nucleare riboflavina dipendente ● JHDM In S.cerevisiae: - Jhd1 e Gis1 H3K36met1/met2 - Rph1 H3K36met2/met3 - Jhd2 H3K4met3 L’espressione di JHD2 è regolata dalla poliubiquitinazione catalizzata da Ube1, Ubc4 e Not4 (subunità di CCR4/NOT)

8 8 Ciclo vitale di Saccharomyces cerevisiae ● È un eucariote unicellulare, può esistere in uno stato aploide o diploide e si divide per gemmazione. ● può portare avanti due tipi opposti di metabolismo chemiorganotrofo fermentazionerespirazione

9 SCOPO DELL’ ESPERIMENTO IDP2 ● ODC1 9 Osservare e comprendere come varia la cinetica di repressione dei geni: Isocitrato deidrogenasi citosolica NAD+- dipendente Decarbossilazione ossidativa dell’ isocitrato ad α-chetoglutarato Trasportatore della membrana mitocondriale interna Trasporta l’α-chetoglutarato dalla matrice mitocondriale al citosol ● Geni della respirazione espressi durante il diauxic shift e ipermetilati. Ceppo di lievito: W303 EP pellet DS pellet refreshTrattamento: -RS3195 -DMSO pellet:30’,1h,2h Estrazione RNA Reverse transcription RT-PCR JHD2 è inibita α-chetoglutarato Fe2+

10 10 Real Time PCR Misura l’ amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l’ efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale. 3 PASSAGGI: 1.retrotrascrizione dell’ mRNA in cDNA 2.amplificazione cDNA 3.quantificazione QUANTIFICAZIONE : - Assoluta - Relativa ΔCt reference = Ct reference - Ct reference endogenous ΔΔCt = ΔCt sample - ΔCt reference fold change = 2 – ΔΔCt ΔCt sample = Ct sample - Ct sample endogenous FLUORESCENZA -SYBR green - sonde ad ibridazione COMPONENTI DELLA REAZIONE: DNA polimerasi due oligonucleotidi dNTPs probe fluorescente DNA target

11 11 RISULTATI

12 12 1) la quantità di RS3195 inoculata non è sufficiente a inibire completamente Jhd2, da verificare attraverso lavori di ChIP; a) se l’inibizione non è completa bisogna capire come inibirla completamente b) se l’inibizione fosse stata completa allora la metilazione non è il meccanismo principale dell’ attivazione ma ha un effetto secondario. 2) meccanismo a feedback negativo: conclusioni Nel caso delle cellule trattate con RS3195 la cinetica di repressione di Idp2 e Odc1 risulta più lenta delle cellule trattate con il DMSO anche se il gene appare, comunque, represso dopo 2h. Come giustifichiamo ciò? Occorre capire se la demetilasi ha solo questo ruolo di modulare l’attivazione, se è proprio necessaria o se è solo una concausa. Per capire questo bisogna verificare se:


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