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Organizzazione della Cellula Eucariotica; Il Ciclo di Divisione Cellulare; Espressione dei Geni. PROGRAMMA.

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Presentazione sul tema: "Organizzazione della Cellula Eucariotica; Il Ciclo di Divisione Cellulare; Espressione dei Geni. PROGRAMMA."— Transcript della presentazione:

1 Organizzazione della Cellula Eucariotica; Il Ciclo di Divisione Cellulare; Espressione dei Geni. PROGRAMMA

2 Un approccio multidisciplinare di tipo biochimico, chimico e genetico risulta fondamentale per lo sviluppo di tecniche dedicate a: -Studio di popolazioni cellulari; -Purificazione di acidi nucleici e proteine; -Determinazione della struttura e dinamica molecolare di acidi nucleici e proteine; -Studio dei sistemi di trasmissione da cellula a cellula, dal citoplasma al nucleo, ecc…

3 Che cosè una CELLULA? La Cellula è lUnità Elementare di Attività Biologica

4 Consideriamo un dispositivo costituito da un recipiente contenente un certo numero di cellule viventi in un ambiente costituito da un terreno nutritizio liquido:

5 I Osservazione Le cellule sono capaci di sopravvivere e di riprodursi; Il loro numero aumenta nel tempo; Lattività proliferativa continua finché non si sono esaurite le risorse nutritive dellambiente ed i prodotti di rifiuto non sono troppo concentrati; Quando lattività proliferativa si è arrestata, può essere ripresa se la coltura viene diluita con altro terreno fresco.

6 Curva di Crescita di Cellule di Mammifero coltivate in vitro

7 II Osservazione A= Composizione chimica del terreno nutritivo B= Composizione chimica delle cellule A = B La composizione chimica delle cellule è diversa da quella dellambiente in cui si trovano

8 III Osservazione A= Variazione della composizione chimica del terreno nutritivo B= Misurare eventuale variazione della composizione chimica delle cellule A = Variabile B = Costante

9 CONCLUSIONI Le cellule devono essere delimitate da una struttura che le separa dal mezzo ambiente detta membrana cellulare o membrana plasmatica; La barriera di permeabilità della membrana non è assoluta, ma selettiva.

10 La cellula è ununità fondamentale di attività biologica, delimitata da una membrana dotata di permeabilità selettiva, e capace di autoriprodursi in un ambiente in cui non vi sono altri sistemi viventi. Definizione secondo Loewy e Siekevitz, 1974

11 Modelli di Organizzazione Cellulare Modello Procariote Modello Eucariote

12 Modello Procariote La parete cellulare costituisce una barriera porosa non selettiva; La membrana cellulare è una barriera permeabile altamente selettiva per lingresso della maggior parte delle sostanze; Il modello procariote è sprovvisto di compartimentazioni interne; Vi è una semplice organizzazione dellapparato informazionale che è confinato in una distinta area nucleare; Grandissima capacità di adattamento alla sopravvivenza che consente di superare rapidamente le modificazioni improvvise delle condizioni ambientali; Allinterno dei procarioti non ci sono ampie differenze; I procarioti non sono in grado di costituire organismi multicellulari.

13 Modello Procariote

14 Modello Eucariote Questo modello è caratterizzato da un elevato grado di compartimentazione interna; Il materiale informazionale è confinato al nucleo che a sua volta è separato dal citoplasma da un involucro nucleare; Il citoplasma contiene numerosi organelli delimitati da membrane e diversi per struttura, organizzazione e funzione; La possibilità di privilegiare luna o laltra delle funzioni cellulari specifiche, consente il processo di differenziamento; La specializzazione strutturale e funzionale comune a più cellule consente loro di riunirsi in associazioni funzionalmente integrate quali quelle rappresentate dagli organismi multicellulari; Sono presenti anche organismi unicellulari come il lievito.

15 Modello Eucariote

16

17 Relazione tra Dimensioni del Genoma e Complessità Biologica

18 Metodi di Indagine della Cellula I metodi di indagine possono essere suddivisi in: Metodi Analitici (Microscopia e Citometria) Metodi Preparativi (Centrifugazione, Cromatografia, Agglutinazione e Cell Sorter)

19 CITOMETRO A FLUSSO

20 BANCO OTTICO = LASER E SENSORI

21 Flow Cytometry Misura le proprietà delle cellule in flusso Flow Sorting Separa le cellule sulla base delle proprietà misurate Gli strumenti sono anche definiti: Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS) DEFINIZIONI

22 Consente alle cellule di passare In fila indiana attraverso Un volume illuminato (camera di conta) in cui esse Disperdono (SCATTER) la luce ed emettono fluorescenza Che è raccolta, filtrata e Convertita in valori numerici o digitali Che sono salvati in un computer.FluidicaOttica Elettronica

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24 LASER SCATTER LATERALE = X = Side Scatter = Right Scatter = Scatter a 90° SCATTER FRONTALE = Y = Forward Scatter = Scatter a 180 ° Otturatore Fotomoltiplicatore Fotodiodo

25 Scatter Frontale=Scatter a 180°=Forward Scatter (FWSc) è una MISURA della DIMENSIONI CELLULARI. Scatter Laterale=Scatter a 90°= Side Scatter (SSC)=Right Scatter (RTSC) è una MISURA della COMPLESSITA INTERNA DELLA CELLULA, ad es. Granulosità Intracitoplasmatica. y x

26 90 deg Scatter FALS Scatter FSC 90°SC

27 I fluorocromi sono molecole (in genere proteine) in grado di essere eccitate ad una determinata lunghezza donda e di emettere luce ad unaltra ben specifica lunghezza donda FLUOROCROMI I filtri dicroici sono dispositivi che, colpiti da un raggio luminoso, sono in grado di far passare la luce caratterizzata da una certa lunghezza donda e di rifletterla ad unaltra lunghezza donda Filtri Dicroici Bandpass Filter Tali filtri permettono il passaggio di determinate lunghezze di onda allinterno di un range e rigettano, senza rifletterle, quelle al di fuori del range

28 Optical Design PMT 1 PMT 2 PMT 5 PMT 4 Bandpass Filters Las er Flow cell PMT 3 Scatter Sensor Sample Filters Dichroic

29 Ethidium PE cis-Parinaric acid Texas Red PE-TR Conj. PI FITC 600 nm300 nm500 nm700 nm 400 nm Common Laser Lines

30 Listmode File FILEVERSION;1.15 BTRIEVE; IBA13-2 collected 6/27/95;28/6/1995;;2;1 PARAM;LS1;400;LS2;600;FL1;460;FL2;400;FL3;300;WID;TIM GAIN;1;1;2;2;0 THRES;0;10;0;5;0;5;1;11;0;5 FLUIDIC;3;4;1;7.20 FCM;357;2;2;1;1;0;0;1;1;1;1;0;1;1;0;1 SUBTRACT;15;0 AUTOCYCLE;1;0;0;0;0;0;0;-1;1;20000;7;0;1;0;1;0 PCBUFFER;374000;1 SERIAL;2 ADBOARD;1;0;0;30;0 PEAKAREA;0;0;0;0 CALIBRATION;300;300;300;300;0;0;0;0 MAINWINDOW;1 PRINTHEADER; Flow cytometry Report;Win-Bryte software - Bryte-HS flow cytometer PRINTFOOTER; Purdue University Cytometry Laboratories PRINTSTATISTICS;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;0;0;1;20;15;1;8;12;5;0;0;5 ROI;1;1;3;3;4;45;65;61;65;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;bird;1;1;1;0;1;1;1;0;1;1;0;;-1;-1;3;0;255;0;0 ROI;2;1;3;3;0;121;41;141;41;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;human;1;1;1;0;1;1;1;0;1;1;0;;-1;-1;3;0;255;0;0 ROI;7;3;5;1;0;0;18;24;63;52;48;16;2;0;2;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;;1;1;1;0;1;1;1;0;1;1;0;;-1;-1;3;5;255;0;0 ROIDATACYTO;7;20022;4845.7;98.7;0.0 ROIDATAHIST;1;2.4;16712;52;53;4044.6;2.4;53;83.5;0.0 ROIDATAHIST;2;2.2;1875;128;128;531.3;1.7;128;7.8;0.0 HISTOGRAM;FALS;24;49;290;320;256;0;Count;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;0;0;255;1;1;C;0;1;1;1;S;0;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;1;1;1;255;0;255 HISTOGRAM;SIDE-SCATTER;290;49;556;320;256;1;Count;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;0;0;255;1;1;C;0;1;1;1;S;0;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;1;1;1;255;0;255 CYTOGRAM;LS1-LS2;24;320;290;591;64;1;0;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;0;0;0;1;1;O;0;1;0;0;S;0;6;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;6;-1;- 1;1;0;1;0;A;B;C;D;1;1;255;0;0;32;32;0;255;0;255 HISTOGRAM;FL2;290;320;556;591;256;3;Count;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;255;0;0;1;1;C;10;1;1;1;S;0;0;1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;0;7;-1;1;1;1;255;0;255 CYTOGRAM;FL2-TIM;556;320;822;591;64;6;3;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;0;0;0;1;1;I;0;1;0;0;S;0;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;- 1;1;0;1;0;A;B;C;D;1;1;255;0;0;32;32;0;255;0;255 LISTDATA 226;0;426;426;243;81;0 412;225;8;426;426;239;0 380;262;2;427;427;245;0 578;348;0;412;412;239;0 529;377;0;431;431;240;0 420;203;0;438;438;243;0 444;221;0;427;0;240;0 383;215;0;421;421;238;0 735;716;0;1027;1027;280;0 499;228;0;431;431;239;0 531;328;0;433;433;241;0 520;218;0;423;423;243;0 471;252;0;425;425;244;0 652;298;0;441;441;240;0 561;291;0;421;421;240;0 608;307;0;415;415;241;0 541;231;0;424;424;245;0

31 log PE (+ +) ( - +) (+ -) (- -) Analisi dei quattro quadranti

32 log PE 1P Fluorescence 2P Fluorescence 90 deg Scatter FALS Scatter Strategie di Gating

33 …Back Gating… In un campione di sangue periferico, noi possiamo operare un gate su una putativa popolazione che per le quelle date proprietà fisiche si identifica, per esempio, con i linfociti. Comunque, può accadere che a quella data putativa popolazione linfocitaria si sovrappongano altri tipi cellulari. Mediante lutilizzo di un marker di fluorescenza che identificherà i putativi linfociti di interesse, noi possiamo tracciare un altro gate sulla regione positiva a quel dato marker e operando un backgating, cioè re-impostando i parametri fisici sul gate di fluorescenza, identificheremo soltanto le cellule positive a quel dato marker di fluorescenza utilizzata.

34 Colture Cellulari

35 Tecniche Sterili o Asettiche Per impedire la contaminazione accidentale dovute a microrganismi provenienti da fonti esterne; Per impedire la contaminazione di se stessi o di terzi.

36 Metodi di Sterilizzazione Sterilizzazione al calor rosso su fiamma; Sterilizzazione al calor secco mediante lutilizzo di un forno ad una temperatura di circa 160°C per almeno 2h ed è particolarmente indicata per la vetreria di laboratorio Sterilizzazione al calore umido mediante lutilizzo dellautoclave a 121°C per almeno 15 min. E particolarmente indicata per mezzi liquidi non sensibili al calore e della vetreria di laboratorio dopo luso

37 Laboratorio di Colture Cellulari Area di Lavoro Abbigliamento di Laboratorio Reagenti Colturali e Vetreria Cappa a Flusso Laminare

38 Le cabine a flusso laminare verticale sono concepite per la protezione del prodotto e dell'operatore durante la manipolazione di materiale non patogeno. Sono particolarmente indicate nel caso sia preferibile non investire l'operatore con il flusso d'aria proveniente dalla zona di lavoro (manipolazione di sostanze allergizzanti o potenzialmente tali, maleodoranti, finemente polverose). Tra le applicazioni più comuni rientrano la manipolazione di prodotti che devono conservare la sterilità, in particolare colture cellulari e materiale biologico sterile, comunque sempre non patogeno, nonché la preparazione e ricostituzione di farmaci.

39 CARATTERISTICHE: Flusso laminare verticale sul piano di lavoro; L'aria espulsa viene sottoposta a filtrazione assoluta; La camera interna è di acciaio inox con angoli arrotondati per facilitare la disinfezione; Lapertura di lavoro è frontale E presente un sistema di allarme in caso di imperfetto funzionamento dei motoventilatori.

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41 Il Ruolo di una Biomolecola In Vivo usando Singoli Animali In Vitro e quindi in un Ambiente Artificiale

42 Richiesta di Soluti Inorganici Soluzioni Saline Fisiologiche Necessità di Ossigeno Perfusione Colture a Breve Termine di circa 24h di Tessuti o Organi Temperatura (37°C) e pH ( )

43 Differenti Tipi di Coltura di Cellule in Vitro Coltura PrimariaColtura Secondaria

44 Coltura Primaria Coltura a Breve Termine Coltura a Lungo Termine < 10 duplicazioni 50/60 duplicazioni

45 Coltura Secondaria Linea Cellulare Continua > 150/200 duplicazioni

46 Linea Cellulare Continua E capace di crescere indipendentemente dallorganismo originale da cui è derivata Crescita ininterrotta per oltre 1 anno Immortale

47 Linea Cellulare Continua Subclone derivata dalla linea cellulare parentale, ma con caratteristiche divergenti/uniche Linee sorelle simultanee stabilizzate da differenti siti dello stesso organismo il campione primario è stato suddiviso in più aliquote prima della semina Linee sorelle seriali stabilizzate dallo stesso organismo, ma in differenti momenti (ad esempio alla diagnosi ed alla recidiva)

48 Stabilizzazione di Nuove Linee Cellulari Estremamente Difficile Rari Successi e Non Prevedibili Importanza delle Aberrazioni Cromosomiche e/o Mutazioni Genetiche Diagnosi vs Ricaduta: diverse percentuali di successo

49 Scarsa riproducibilità della metodica in altri laboratori The leukemia-Lymphoma Cell Line FactsBook di H.G. Drexler, 2000.

50 IN VIVO La pressione parziale di ossigeno nei normali fluidi corporei è significativamente più bassa di quella dellaria. Nel midollo osseo umano è di circa il 2-5%. EX VIVO La pressione parziale di ossigeno negli incubatori al 5% di CO2 è di circa 15-20%!!! In alcuni casi è utile ridurre la fase gassosa di ossigeno tra 1-10%. Alcune cell lines crescono al 5% di ossigeno ed il 6% di anidride carbonica Incubatore

51 Deterioramento della Coltura Le cellule neoplastiche cessano di proliferare Overgrowth di fibroblasti o macrofagi Overgrowth di cellule linfoblastoidi EBV+ Possibili ragioni BB BB

52 Medium di coltura: RPMI 1640, IMDM, McCoys, Alpha MEM e DMEM Fattori di crescita: EPO, G-CSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-6, SCF, PHA e CM Supporto colturale (plastica) Concentrazione cellulare Superamento della crisi di stabilizzazione LA STABILIZZAZIONE DI UNA NUOVA LINEA CELLULARE: PUNTI CRITICI

53 Ioni Inorganici Cloruro di calcio anidro Solfato di magnesio anidro Cloruro di potassio Nitrato di potassio Cloruro di sodio Fosfato di sodio bibasico Bicarbonato di Sodio Medium di Coltura Ioni Inorganici

54 Alanina Arginina Asparagina Acido Aspartico Cisteina Glutamina Acido Glutamico Glicina Istidina Isoleucina Medium di Coltura Aminoacidi-Isomeri L Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Prolina Serina Treonina Triptofano Tirosina Valina

55 Biotina Pantotenato Acido Folico Inositolo Nicotinamide Piridossina Riboflavina Tiamina Vitamina B12 Medium di Coltura Vitamine

56 Glucosio Hepes Rosso fenolo Sodio - Piruvato Siero fetale bovino (10 oppure 20%) Aminoacidi non-essenziali Medium di Coltura Altri Componenti

57 La membrana Plasmatica: Individualità e Socialità della Cellula (T. Alescio et al.) 1.Isolamento; 2.Comunicazione; 3.Compartimentazione; 4.Integrazione funzionale intracellulare. SIGNIFICATO BIOLOGICO DELLA MEMBRANA

58 1.ISOLAMENTO E una condizione necessaria a garantire lindividualità del corpo cellulare e la sua integrità chimica; tale condizione è fondata sulla capacità della membrana di comportarsi come una vera e propria barriera selettiva. Ogni cellula mantiene una composizione chimica diversa da quella dellambiente; Ogni cellula può mantenere la sua individualità genetica e metabolica; Ogni cellula mantiene lautonomia eventualmente necessaria per la competizione dalla quale scaturisce il processo evolutivo.

59 2. COMUNICAZIONE Poiché ogni cellula rappresenta un sistema termodinamico aperto, lisolamento non può essere assoluto ed i sistemi di comunicazione devono assolvere a 3 compiti: Consentire il passaggio selettivo, in direzione definita, di sostanze nutritive e dei prodotti di rifiuto; Capacità di ricevere dallesterno stimoli e segnali in maniera tale da evocare gli eventi genetici e metabolici adeguati che configurano risposte cellulari specifiche agli stimoli ricevuti; Realizzare le connessioni intercellulari dirette ed indirette necessarie ad assicurare la solidarietà funzionale di tutte le componenti dellorganismo.

60 3. COMPARTIMENTAZIONE E una condizione tipica degli eucarioti nei quali lesistenza di sistemi intracellulari di membrane suddivide il corpo cellulare in una serie di scomparti ciascuno dei quali può acquisire una propria attività specializzata. NUCLEO LISOSOMI

61 4. INTEGRAZIONE FUNZIONALE INTRACELLULARE La membrana plasmatica e le membrane intracellulari svolgono la funzione di supporti utili per ancorare ed ordinare in sequenze spaziali ben definite molecole destinate a svolgere funzioni collegate ed interdipendenti

62 Quando gli enzimi E1, E2 ecc… si trovano in soluzione nel citoplasma, la loro probabilità di incontro con il rispettivo substrato è proporzionale alle loro concentrazioni. La reazione può avvenire soltanto nel momento in cui i movimenti disordinati di diffusione entro la cellula, conducono allinterazione di substrati ed enzimi.

63 Se invece gli enzimi E1, E2 ecc… sono strettamente associati luno allaltro in un grande complesso multienzimatico, la probabilità che il primo prodotto intermedio, liberato da E1, incontri E2, che si trova nelle immediate vicinanze, risulta molto maggiore.

64 Unintelligente strategia biologica è quella di inserire una sequenza di molecole funzionalmente interdipendenti nella compagine di un tratto di membrana plasmatica o intracellulare; questa, quindi, può offrire, nel caso del complesso multienzimatico, la struttura di supporto richiesta per la sua integrazione funzionale.


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