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CRIOBIOLOGIA STUDIO DELLA VITA A BASSE TEMPERATURE.

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Presentazione sul tema: "CRIOBIOLOGIA STUDIO DELLA VITA A BASSE TEMPERATURE."— Transcript della presentazione:

1 CRIOBIOLOGIA STUDIO DELLA VITA A BASSE TEMPERATURE

2 CRIOPRESERVAZIONE Le cellule umane e animali possono essere criopreservate in azoto liquido a -196°C per più di 10 anni senza significativi cambiamenti delle loro caratteristiche biologiche Le cellule vitali possono essere recuperate in qualsiasi momento

3 Metodica Raccogliere le cellule fresche oppure in fase logaritmica della loro crescita nel caso di linee cellulari Determinare il numero di cellule e la percentuale di vitalità Centrifugare la sospensione cellulare ed eliminare il sovranatante Preparare il medium di congelamento: medium di coltura al 20% FBS e 10% di DMSO Risospendere il pellet nel medium di congelamento rapidamente ed in ghiaccio Distribuire 1ml nelle appropriate criovials opportunamente siglate Dare inizio al processo di congelamento

4 Determinare il numero di cellule e la percentuale di vitalità Risospendere la sospensione cellulare in un eguale volume di Trypan Blue (20 l sospensione cellulare + 20 l Trypan); Consentire alla sospensione di scorrere per capillarità allinterno della camera; Effettuare la conta delle cellule non colorate e di quelle colorate.

5 Determinare il numero di cellule e la percentuale di vitalità: NOTE Il Trypan Blue è un colorante che è in grado di colorare in blu le cellule necrotiche; La percentuale di vitalità è calcolata mediante la seguente formula: N° di Cell. Vitali/N° di Cell. Blu + Cell. Vitali X 100 La [ ] cellulare è calcolata mediante la seguente formula: N° Cell. Vitali (media 3 Quadranti) X X 2

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8 Punti Critici Il congelamento e lo scongelamento non migliorano lo status quo delle cellule Gli agenti crioprotettivi possono essere Dimetilsulfossido (DMSO) o Glicerolo; proteggono le cellule dai danni indotti dalla formazione dei cristalli di ghiaccio durante il criocongelamento La lunga esposizione a temperatura ambiente al DMSO può danneggiare irreversibilmente le cellule Non è necessario sterilizzare il DMSO poiché in forma pura è letale per i batteri Risospendere il pellet nel medium di congelamento rapidamente ed in ghiaccio

9 Punti Critici Se la velocità di raffreddamento è troppo bassa, la cellula è esposta a [ ] crescenti di soluti cellulari dovute alla formazione di ghiaccio nel mezzo di soluzione ALTA [ ] SOLUTI VARIAZIONI DI pH DISIDRATAZIONE > PRESSIONE OSMOTICA

10 Punti Critici Se la velocità di raffreddamento è troppo alta, si avrà la formazione di nuclei di cristallizzazione sia nella soluzione che allinterno della cellula DANNO MECCANICO CRISTALLI INTERNI CRISTALLI ESTERNI DISTRUZIONE DELLA MEMBRANA CELLULARE

11 ESISTE LA VELOCITA IDEALE? Il raffreddamento deve essere lento in modo tale da evitare la formazione di ghiaccio! Il raffreddamento deve essere nello stesso tempo rapido in modo tale da non danneggiare la cellula per disidratazione! OTTIMIZZAZIONE DELLA VELOCITA NEL VALORE DI -1°C/MINUTO

12 QUALE SISTEMA UTILIZZARE PER LE LINEE CELLULARI CONTINUE? Utilizzo di freezer meccanici programmabili, ma sono molto costosi!!! Utilizzo di contenitori di polistirolo seguito da trasferimento prima a -20°C e poi a -80°C Utilizzo dei contenitori CRIOSTEP LA VELOCITA DI RAFFREDDAMENTO DI -1°C/MINUTO

13 Contenitori Nalgene Isopropanolo Trasferimento in Tanica Criogenica Fase di Vapori di Azoto Liquido Immediato trasferimento delle criovials a -80°C per almeno 4 ore Trasferimento in Tanica Criogenica Fase Liquida di Azoto

14 CRIOPRESERVAZIONE Vantaggi Si riduce il rischio di contaminazione microbica Si riduce il rischio di cross-contaminazione Si riduce il rischio di drift genetico e morfologico Si possono utilizzare linee cellulari a ben precisi passaggi Notevole riduzione di costi e tempo

15 BANCA del CORDONE OMBELICALE Perché si costituiscono le Banche di Cordone Ombelicale? Che cosa è un Cordone Ombelicale?

16 CORDONE OMBELICALE E una formazione anatomica che mette in comunicazione la placenta con il feto E costituito da: due arterie ombelicali, una vena ombelicale e dalla sostanza gelatinosa chiamata Gelatina di Wharton Dalla placenta origina il sangue arterioso ossigenato che in senso centrifugo raggiunge il feto e da questo origina il sangue venoso non ossigenato Subito dopo la nascita, il cordone viene reciso a circa 10 cm dal piano cutaneo del neonato e chiuso Dopo la recisione del cordone, i vasi ombelicali si trombizzano rapidamente ed il moncone del cordone si essicca assumendo un colorito bruno-nerastro

17 Come si colleziona il Sangue Cordonale? Due Tecniche di Raccolta 1)Raccolta del sangue cordonale mentre la placenta è ancora in utero 2)Raccolta del sangue cordonale dopo lallontanamento della placenta

18 Vantaggi della I Tecnica Il volume della raccolta è maggiore se il cordone è chiuso rapidamente Il volume della raccolta è consistente se la raccolta viene effettuata repentinamente

19 Svantaggi della I Tecnica Può interferire negativamente con limportante processo di secondamento La tecnica di raccolta descritta non è sempre attuabile nella sala parto

20 Vantaggi della II Tecnica La raccolta può essere effettuata da personale paramedico Svantaggi della II Tecnica Basso numero di cellule raccolte Aumentato rischio di contaminazioni batteriche e formazione di coaguli

21 Perché si utilizzano le cellule cordonali? Il sangue cordonale contiene Cellule Staminali Possono essere utilizzate per trattare un ampio numero di patologie maligne e non maligne.

22 Patologie Maligne Leucemia Acuta Linfoblastica Leucemia Acuta Mieloide Leucemia Mieloide Cronica Neuroblastoma Anemia Refrattaria con Eccesso di Blasti

23 Patologie Non-Maligne Anemia di Fanconi Anemia Severa Aplastica Talassemia Immunodeficienza Combinata Severa Sindrome di Lesch-Nyhan

24 Cord Blood Contiene cellule staminali che si autorinnovano, mantenendo il pool delle cellule staminali stesse, e cellule progenitrici più mature. Il numero totale di queste cellule è maggiore rispetto a quello presente nel midollo adulto.

25 Classificazione delle Cellule Staminali TOTIPOTENTI PLURIPOTENTI MULTIPOTENTI OLIGOPOTENTI UNIPOTENTI Wagers e Weissman Cell, Vol 116, pp , 2004

26 Cellule Staminali Multipotenti Esse sono in grado di dare origine ad un subset of cell lineages A tuttoggi le cellule staminali ematopoietiche multipotenti sono quelle più studiate e caratterizzate sia biologicamente che funzionalmente.

27 CURT CIVIN Nel 1984 scopre lantigene CD34

28 ANTIGENE CD34 Rappresenta il marcatore delle cellule staminali che si autorinnovano nonché dei progenitori ematopoietici più a valle

29 CD34 CD90 C-kit Flt3 -Flk2 Il CD90, il CD133 ed il CD34 sono antigeni della cellula staminale; Il CD90 è possibilmente coinvolto nelle interazioni cellula-cellula; Il CD133 è una proteina Prominin-like; Il C-kit o CD117 è il recettore per il fattore di crescita Stem Cell Factor; Flt3-Flk2 o CD135 è il recettore per Flt3 ligand ad attività tirosin-chinasica. HLA-DR- CD133

30 BANCAGGIO DI SANGUE CORDONALE Fasi Deteminazione del volume di sangue da crioconservare; Preparazione delle provette da dedicare ai vari test: Emocromo, Determinazione del gruppo sanguigno, Tipizzazione HLA, Esami di biochimica clinica e Conta assoluta di cellule CD34; Preparazione della soluzione crioprotettiva; Inizio della fase di congelamento.

31 Deteminazione del Volume di Sangue da Crioconservare Determinare il peso in gr. della sacca di raccolta; Determinare il peso lordo della sacca di raccolta contenente il sangue cordonale; Determinare il peso netto sottraendo la tara al peso lordo; Il peso espresso in grammi=Volume espresso in ml Il peso netto corrisponderà pertanto al volume totale di sangue da crioconservare.

32 Determinazione dellEmocromo Rappresenta uno dei test più importanti della fase di pre-congelamento Determina il numero di cellule mononucleate da congelare che in media è rappresentato da circa 500x10E6 cellule totali

33 Determinazione delle Cellule CD34 Applicazione della Metodica in Citometria a Flusso Determina il valore assoluto delle cellule CD34+ (0,1- 0,5%) che risulta di vitale importanza ai fini trapiantologici. Determinazione del numero di eritroblasti.

34 Conta Assoluta Esecuzione dellEsame Emocromocitometrico La strumentazione è inaffidabile al di sotto di un numero di GB inferiore a 100/ l ovvero /ml

35 E necessaria una metodologia in grado di effettuare una conta di eventi rari SOLUZIONE DEL PROBLEMA Citometria a Flusso

36 CITOMETRO A FLUSSO

37 PROTOCOLLO GRATAMA JW et al, J. Immunol. Methods, 2000 Anne M. Brocklebank and Rosemary L. Sparrow Cytometry, 2001 Esecuzione del Saggio di Conta e Diapositive P. Mirabelli

38 Linfociti like Eritroblasti Monociti like Granulociti-like Cellule Vitali 7-AAD Negative Cellule Morte 7-AAD positive Biglie Analisi delle cellule vitali

39 Nuvola di cellule CD34+ Numero eventi biglie : 6672 Numero eventi cellule vitali: Numero eventi cellule CD34+: 229 Percentuale di cellule CD34+ = 229 / = 0.13% Valore assoluto di cellule CD34 = 229 (Eventi CD34+) / 6672 (Eventi biglie) x (Numero di biglie Troucount presente nella provetta) / 2 (Volume finale presente nella provetta da acquisire) x 20 (Fattore di diluizione ottenuto diluendo 100ul di sangue cordonale in 2 ml di Lisante Cloruro dammonio) = cellule CD34/ml

40 SIMPLIFIED SCHEME OF STEM CELL DIFFERENTIATION hematopoietic stem cellmyeloid blast CD34 CD90 CD133 CD117 VEGFR CD105 ALDH ABCG2 erythroid CDCP1 ABCB1 CD318

41 M. Goodell 2001

42 ABC transporters involved in drug resistance GeneProtein/aliasDrug effluxed ABCA2ABCA2Doxo, VP16, vinblastine ABCB1MDR1Colchi, doxo, VP16 ABCC1MRP1Doxo, dauno, vincristine ABCC2MRP2Vinblastine, cisplatinum ABCC3MRP3MTX, VP16 ABCC4MRP46-MP, 6-TG ABCC5MRP56-MP, 6-TG ABCC6MRP6VP16 ABCC11MRP85-FU ABCG2CDw338Mitoxantrone, imatinib, Hoechst

43 Dean, 2005

44 Preparazione della soluzione crioprotettiva Essa è costituita da: 80% di Destrano, una soluzione fisiologica; 20% di Dimetilsulfossido, lagente crioprotettivo. Il volume della soluzione crioprotettiva è pari a quello della sospensione di cellule cordonali da criopreservare

45 Inizio della Fase di Congelamento Addizionare la soluzione crioprotettiva alla sospensione cellulare cordonale avendo cura di lavorare in ghiaccio; Preparazione delle aliquote di sangue cordonale già diluito in soluzione criopreotettiva; Preparazione delle aliquote-pilota per potere eseguire test di controllo; Avviare la vera e propria fase di congelamento.

46 …Dare inizio al processo di congelamento… Punti Critici Congelatore Programmabile 1°C/min -25°C 5-10°C/min -100°C Trasferimento in Tanica Criogenica in Fase di Vapori

47 FASE DI QUARANTENA E necessario esplicare durante questa fase tutti i test atti a validare lutilizzo del sangue cordonale a scopi trapiantologici Esami microbiologici; Studi Funzionali mediante lapplicazione di saggi a colonie.

48 TRAPIANTO DI CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE QUANTE CELLULE CD34+ CORDONALI E NECESSARIO INFONDERE IN UN ADULTO? Schema:1x10 5 /kgsogg. 70kg70x10 5 DA UN CORDONE OMBELICALE SI RICAVANO CIRCA x 10 5 cellule totali Pertanto lindicazione del C.O. è attualmente limitata alloncologia pediatrica

49 Prospettive Future Espansione Ex-Vivo; Migliorare lefficienza di Homing; Trapiantare più unità di sangue cordonale.

50 Homing delle Cellule Staminali Ematopoietiche Con il termine Homing si definisce quel processo biologico che conduce le cellule staminali ematopoietiche trapiantate a raggiungere la loro cavità, ovvero nicchia nel midollo osseo.

51 Le varie fasi di Homing di una cellula staminale ematopoietica prevedono: 1.Rolling sulle cellule endoteliali attraverso il legame con E e P-Selectine; 2.Adesione attraverso VCAM-1 espresso dalle stesse cellule endoteliali; 3.Migrazione trans-endoteliale via VLA-4/VCAM-1 come anche via VLA-4 e VLA-5/Fibronectina. Fasi di Homing

52 Perché è importante aumentare lefficienza di Homing? Perché soltanto il circa 5% di progenitori umani CD34+ raggiunge la nicchia midollare dellospite! La percentuale è leggermente variabile e correla con lo stato del ciclo cellulare delle cellule primitive trapiantate; Lattecchimento è massimo in cellule quiescienti. LIMITA FORTEMENTE LUSO DEL CORD BLOOD

53 Christopherson et al, Science 2004 Modulation of Hematopoietic Stem cells Homing and Engrafment by CD26 Uno dei protagonisti che limita fortemente lHoming e quindi lattecchimento dei progenitori primitivi ematopoietici è la molecola CD26. CD26 è una DPPIV/Dipeptidilpeptidasi IV che ha la funzione di rimuovere dipeptidi dalla estremità aminoterminale delle proteine.

54 CXCR4 SDF-1 :-) Le cellule stromali producono SDF-1 che attrae le cellule positive per CXCR4. SDF-1

55 Sette domini transmembrana NH2 HOOC Struttura generale dei recettori per chemochine CXCR

56 CD26 CXCR4 SDF-1 :-( CD26 cliva SDF-1 bloccando il meccanismo chemiotattico SDF-1

57 EVIDENZE SPERIMENTALI, Science 2004 Lespressione endogena di CD26 da parte delle cellule del donatore modulano negativamente lhoming e quindi lattecchimento; Linibizione dellattività o la delezione del CD26 migliora sorprendentemente lefficienza di attecchimento. Ulteriori studi sono necessari allo scopo di utilizzare nellambito clinico inibitori del CD26 nel momento in cui la sorgente staminale ematopoietica è limitata.

58 CD26 CXCR4 :-) AMD3100 Diprotin-A Mobilizzatore Esaltatore di Homing

59 … Il Laboratorio è solo un altro posto per giocare … Kary Mullis, 1998 Premio Nobel per la chimica nel 1993 per aver scoperto la PCR

60 La membrana Plasmatica: Individualità e Socialità della Cellula (T. Alescio et al.) 1.Isolamento 2.Comunicazione 3.Compartimentazione 4.Integrazione funzionale intracellulare SIGNIFICATO BIOLOGICO DELLA MEMBRANA

61 1.ISOLAMENTO E una condizione necessaria a garantire lindividualità del corpo cellulare e la sua integrità chimica; tale condizione è fondata sulla capacità della membrana di comportarsi come una vera e propria barriera selettiva. Ogni cellula mantiene una composizione chimica diversa da quella dellambiente Ogni cellula può mantenere la sua individualità genetica e metabolica Ogni cellula mantiene lautonomia eventualmente necessaria per la competizione dalla quale scaturisce il processo evolutivo

62 2. COMUNICAZIONE Poiché ogni cellula rappresenta un sistema termodinamico aperto, lisolamento non può essere assoluto ed i sistemi di comunicazione devono assolvere a 3 compiti: Consentire il passaggio selettivo, in direzione definita, di sostanze nutritive e dei prodotti di rifiuto Capacità di ricevere dallesterno stimoli e segnali in maniera tale da evocare gli eventi genetici e metabolici adeguati che configurano risposte cellulari specifiche agli stimoli ricevuti Realizzare le connessioni intercellulari dirette ed indirette necessarie ad assicurare la solidarietà funzionale di tutte le componenti dellorganismo

63 3. COMPARTIMENTAZIONE E una condizione tipica degli eucarioti nei quali lesistenza di sistemi intracellulari di membrane suddivide il corpo cellulare in una serie di scomparti ciascuno dei quali può acquisire una propria attività specializzata. NUCLEO LISOSOMI

64 4. INTEGRAZIONE FUNZIONALE INTRACELLULARE La membrana plasmatica e le membrane intracellulari svolgono la funzione di supporti utili per ancorare ed ordinare in sequenze spaziali ben definite molecole destinate a svolgere funzioni collegate ed interdipendenti

65 Quando gli enzimi E1, E2 ecc… si trovano in soluzione nel citoplasma, la loro probabilità di incontro con il rispettivo substrato è proporzionale alle loro concentrazioni. La reazione può avvenire soltanto nel momento in cui i movimenti disordinati di diffusione entro la cellula, conducono allinterazione di substrati ed enzimi.

66 Se invece gli enzimi E1, E2 ecc… sono strettamente associati luno allaltro in un grande complesso multienzimatico, la probabilità che il primo prodotto intermedio, liberato da E1, incontri E2, che si trova nelle immediate vicinanze, risulta molto maggiore.

67 Unintelligente strategia biologica è quella di inserire una sequenza di molecole funzionalmente interdipendenti nella compagine di un tratto di membrana plasmatica o intracellulare; questa, quindi, può offrire, nel caso del complesso multienzimatico, la struttura di supporto richiesta per la sua integrazione funzionale.

68 ORGANIZZAZIONE MOLECOLARE DELLA MEMBRANA Il modello utilizzato per lo studio della membrana plasmatica è rappresentato dal globulo rosso dei mammiferi per i seguenti motivi: 1.Possono essere ottenuti facilmente mediante un prelievo di sangue periferico 2.Durante il processo di differenziamento elimimano la maggior parte degli organelli ed il nucleo 3.Ottenimento di preparazioni assai pure della membrane plasmatiche stesse

69 Le Membrane Plasmatiche sono costituite da due classi fondamentali di componenti: LIPIDI COMPLESSI PROTEINE + MOLECOLE DI ZUCCHERI = GLICOLIPIDI E GLICOPROTEINE

70 COMPONENTE LIPIDICA I Diversi tipi di Lipidi che si ritrovano nelle membrane cellulari possono essere riuniti in due classi fondamentali: A. Fosfolipidi B. Sfingolipidi Gangliosidi Cerebrosidi Sfingomieline C. Colesterolo

71 A. Fosfolipidi I fosfolipidi risultano dalla combinazione di una molecola di glicerolo con due molecole di acidi grassi, una di acido fosforico ed un raggruppamento variabile da tipo a tipo di fosfolipide.

72 B. Sfingolipidi Gli sfingolipidi sono costituiti da una molecola chiamata sfingosina combinata con una molecola di un acido grasso. A questa struttura di base si aggiunge un gruppo laterale di diverso tipo che conferisce alla molecola la propria individualità; sulla base della natura di questo gruppo si possono identificare le tre diverse sottoclassi (sfingomieline, cerebrosidi e gangliosidi).

73 C. Colesterolo E presente esclusivamente nelle membrane delle cellule eucariotiche.


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