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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMA Facoltà di medicina e chirurgia- Facoltà di veterinaria- Facoltà di farmacia Corso di Laurea Specialistica in Biotecnologie.

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Presentazione sul tema: "UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMA Facoltà di medicina e chirurgia- Facoltà di veterinaria- Facoltà di farmacia Corso di Laurea Specialistica in Biotecnologie."— Transcript della presentazione:

1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMA Facoltà di medicina e chirurgia- Facoltà di veterinaria- Facoltà di farmacia Corso di Laurea Specialistica in Biotecnologie per la Salute ISOLAMENTO DI CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI DA SANGUE DEL CORDONE OMBELICALE Laureando: Arianna Beduschi Relatore: Prof. Roberto Sala Tutore: Dott. Stefano Negri

2 CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI Cellule staminali adulte multipotenti Capacità di aderire a superfici di plastica Espressione di markers specifici POSITIVI: CD90; CD73; CD105; CD44; CD29; HLA-ABC NEGATIVI: CD34; CD45; CD14; HLA-DR Capacità di differenziare: Adipociti; osteociti; cellule muscolari; Altro:neuroni, epatociti … Fonti delle MSCs

3 FONTI DI MSCs Agoaspirato midollare Tessuto adiposo Placenta Sangue e tessuti cordonali

4 IL SANGUE CORDONALE COME FONTE DI MSCs tessuto di scarto presenza di staminali mesenchimali ed emopoietiche MSCs da UCB hanno le stesse caratteristiche di quelle isolate da midollo uso autologo ed allogenico dibattito tra ricercatori sullaccessibilità alle MSCs: difficoltà disolamento meno MSCs rispetto midollo e Whartons jelly

5 Obiettivo: tutelare sempre il diritto della madre a conservare il proprio sangue del cordone ombelicale per uso autologo e al tempo stesso garantire la possibilità di donare tale sangue per uso allogenico

6 Arrivo sacca sangue cordonale Calcolo del volume netto di sangue cordonale raccolto: Peso lordo sacca – peso sacca ( tara = 28 g) = peso netto sacca Peso netto sacca / peso specifico sangue (1.05 g/ml) = volume sacca con anticoagulante Volume sacca con anticoagulante – volume anticoagulante (20 ml) = volume netto sangue cordonale Aliquota per la ricerca: attenzione a NON pregiudicare mai la conservazione del sangue raccolto sia per uso autologo che allogenico!

7 Prelievo 0,5 ml per emocromo e analisi multiparametrica al citofluorimetro Analisi multiparametrica al citofluorimetro: CD 34 – APC CD 45 – PERPC CD 90 – FITC CD 73 - PE Cellule MSCs-like CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITÀ CON HISTOPAQUE-1007 Sangue intero Histopaque Analisi multiparametrica al citofluorimetro: CD 34 – APC CD 45 – PERPC CD 90 – FITC CD 73 - PE Cellule MSCs-like Plasma EritrocitiHistopaque Cellule mononucleate

8 SELEZIONE NEGATIVA DELLE CELLULE Utilizzo di biglie paramagnetiche rivestite di Ab CD34. Selezione negativa delle MSCs in quanto tali cellule non esprimono CD34.

9 COLTURE CELLULARI IMDM + 10%FBS + bFGF 10ng/ml+ ITS + 50 mg/ml

10 I dati forniti dallemocromo e dallanalisi multiparametrica al citofluorimetro sono stati utilizzati per calcolare la % di MSCs sulla frazione di cellule mononucleate nel sangue e dopo estrazione con Histopaque. La procedura di gating applicata è stata:

11 RISULTATI sample% MSCs /cell mono nel sangue % MSCs/cell mono dopo estrazione Histopaque Cordoni di peso superiore a 90 g: Cord 100,0580,074 Cord 110,0780,040 Cord 120,1190,014 Cord 130,1520,132 Cord 150,0100,140 media0,083 ± 0,0550,080 ± 0,055 Cordoni di peso inferiore a 90 g: Cord 180,0780,382 Cord 190,0290,306 Cord 200,0920,177 media0,066 ± 0,0330,288 ± 0,104

12 RISULTATI Efficienza di estrazione : (42,19 ± 16,37) %

13 Allaumentare del volume di sangue cordonale raccolto aumenta la quantità di MSCs-like presenti. In proporzione la resa destrazione con Histopaque rimane la stessa. RISULTATI

14 La percentuale di MSCs-like diminuisce nel sangue intero con laumentare del tempo trascorso tra raccolta e lavorazione. I tempi migliori per lestrazione con Histopaque sono tra 5 e 15 h. RISULTATI

15 Si ottengono colture dal 13% dei cordoni analizzati, percentuale che sale al 33,3 % se si considerano solo i cordoni di peso > 90g.

16 CONCLUSIONI Lanalisi multiparametrica al citofluorimetro dimostra la presenza di cellule MSCs-like sia nel sangue cordonale che nella frazione di cellule mononucleate da esso ottenute. Con lestrazione mediante centrifugazione in gradiente di densità non si perdono MSCs-like, anzi in alcuni casi aumenta la %. Allaumentare del volume di sangue raccolto aumenta la % di MSCs-like. Si ottengono colonie di MSCs-like solo da cordoni molto abbondanti, generalizzando con volume > 40 ml. I tempi migliori per la lavorazione del sangue cordonale sono tra 5 e 12 ore MA sono state ottenute colonie di MSCs-like da un cordone lavorato + di 24 h dopo la raccolta.? La coltura di MSCs-like è difficoltosa.

17 Cautela nel generalizzare i nostri risultati perché ottenuti su un ristretto numero di cordoni e su volumi ridotti in alcuni casi: Infatti sempre, in ogni caso, sono stati tutelati i diritti della madre e del neonato e la possibilità di donare il sangue cordonale per uso allogenico. Probabilmente se ci fosse la possibilità di lavorare tutto il sangue di una sacca idonea al congelamento la % di cordoni ombelicali da cui si ottengono colonie di cellule MSCs-like aumenterebbe.

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