La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici Dott. MASSIMILIANO BERGALLO Dipartimento di Sanità

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici Dott. MASSIMILIANO BERGALLO Dipartimento di Sanità"— Transcript della presentazione:

1 TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici Dott. MASSIMILIANO BERGALLO Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia Università degli Studi di TorinoDott. MASSIMILIANO BERGALLO Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia Università degli Studi di Torino

2 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

3 primers DNA polimerasi DNA genomico 1955 A. Kronembreg e coll. (Stanford University) scoprono la DNA-polimerasi cellulare

4 DNA polimerasi primer Nucleotide (dNTP)

5

6

7 APERTURA DOPPIA ELICA DEL DNA LEGAME DEI PRIMERS DI INNESCO DUPLICAZIONE DEL DNA STAMPO Nel 1983 K.B. Mullis utilizzò la DNA polimerasi in una reazione di polimerizzazione ciclica: la PCR

8 Primers DNA polimerasi ELEMENTI NECESSARI PER LA REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE DNA STAMPO DESOSSIRIBOSIO Base Azotata (Adenina, Timina, Citosina, Guanina, Uracile) Desossi Nucleotidi trifosfati (dNTP )

9 fase 1: DENATURAZIONE La doppia elica di DNA stampo è aperta al calore 94°C

10 fase 2: ANNEALING I primers si appaiano alle sequenze complementari sul DNA stampo 37-72°C

11 72°C fase 3: ESTENSIONE La DNA polimerasi allunga gli inneschi e produce 2 nuove catene di DNA

12 IL PROCESSO SI RIPETE

13

14 Ad ogni ciclo il numero di molecole di DNA copiato raddoppia

15 Siti dei primers DNA estratto dal campione DNA target Lunghezza DNA amplificato

16 Numero di cicli Numero di molecole di amplificati Resa teorica di una reazione di PCR a partire da una singola copia di DNA Y= N2 n Y= numero molecole di DNA amplificato N= numero molecole di DNA di partenza n= numero dei cicli di PCR

17 LA FORMULA DELLA PCR Y =N (1+E) n Y = resa di amplificazione N = numero di molecole di DNA di partenza E = efficienza di reazione n = numero di cicli di amplificazione efficienza media resa finale (20 Cicli) % teorica max

18 Log [DNA] n° cicli Fase Geometrica Plateau Fase Lineare LA REAZIONE DI PCR

19 Competizione tra il prodotto dei cicli precedenti e i primers per l'ibridazione Inattivazione termica dellenzima Riduzione del rapporto molare tra le concentrazioni della DNA- polimerasi e del DNA Riduzione progressiva dellefficienza di denaturazione e/o di ibridazione Distruzione degli amplificati per lattività esonucleasica 5>3 della polimerasi Accumulo di pirofosfati (inibitori della polimerasi) Progressiva diminuzione della concentrazione di uno o più componenti necessari alla reazione (?) CAUSE DELLEFFETTO PLATEAU

20 Scelta dei primers Condizioni di reazione Contaminazione Specificità Sensibilità Scelta dei primers Eterogeneità genomica Presenza di inibitori Tipo di campione Efficienza della reazione Riproducibilità Standardizzazione delle fasi del metodo: preparazione del campione protocollo di PCR sistema di rivelazione PRINCIPALI FATTORI CHE INFLUENZANO LA RESA DELLA PCR

21 PCR: PARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE Acido Nucleico TARGET Disegno dei Primers Temperatura di Annealing Concentrazione di Mg++ Concentrazione di dNTPs Qualità e quantità di Enzima Forza Ionica del tampone Presenza di Cosolventi Parametri dei Cicli Numero di Cicli

22 I REAGENTI DELLA REAZIONE DI PCR

23 DNA TARGET NATURA: Omogeneo (plasmide purificato): ogni molecola è identica e rappresenta la sequenza da amplificare Eterogeneo (mix di diverse molecole di DNA, come il DNA genomico, sospensione cellulari o materiale biologico) Purezza: intesa come assenza di componenti che diminuiscono lefficienza della PCR

24 Troppo DNA Troppo RNA Presenza di emoglobina Eparina Ioni metallici SDS Composti Aromatici Etanolo Urea Detergenti Ecc. Inibitori della PCR DNA TARGET

25 DNA TARGET: Il DNA umano è costituito da circa 3.3 x 10 9 bp, (1bp= 650 dalton) Il DNA contenuto in una cellula pesa circa 6.6 x10 -6 ug 1 ug di DNA genomico corrisponde a circa 5 x pmoli Circa cellule umane contengono 1 ug di DNA 3 pg di DNA genomico contengono 1 copia di ogni gene umano QUANTITA OTTIMALE 0.1 a 1-2 ug di DNA genomico Per reazione di PCR

26 Estrema cura nella scelta della regione da amplificare Estrema purezza Lunghezza: paia di basi (non meno di 16 bp) Equilibrato rapporto AT/GC Tm comprese tra 45-68° C Tm simili (+/- 2 C) OLIGONUCLEOTIDI O PRIMERS SPECIFICI DEGENERATI UNIVERSALI

27 Evitare sequenze inusuali come serie di purine o pirimidine Evitare sequenze palindromiche che provocano strutture secondarie (loop). Le estremità 3 non devono essere tra loro complementari: formazione dei primers-dimeri - -OH - OH- - -OH Taq DISEGNO DEI PRIMERS PROVARE EMPIRICAMENTE IN FASE DI OTTIMIZZAZIONE La concentrazione utilizzata è: mM ( pmoli/reazione)

28 FORMAZIONE DEI PRIMERS-DIMERI

29

30

31

32 TAMPONE DI REAZIONE controllo pH (attività Taq polimerasi) controllo forza ionica …. (termostabilità Taq polimerasi) Cosolventi: diminuiscono la temperatura di denaturazione e di annealing: DMSO, formamide, glicerolo Standard PCR 1x Taq Buffer 10mM Tris-HCl: pH 8.3 a t.a. 50mM KCl 1.5mM MgCl 2 (!!!!)

33 Necessario per lattività enzimatica Stabilizza libridazione del DNA Sottratto alla reazione da diversi fattori: DNA, EDTA, supporto in vetro (In Situ), dNTPs. Legato dai dNTP (gruppi fosfato) Concentrazione ottimale: dNTP+ primers+ DNA Effettuare sempre una titolazione di Mg++ quando vengono cambiati i parametri di reazione CONCENTRAZIONE DI MgCl 2 PROVARE EMPIRICAMENTE IN FASE DI OTTIMIZZAZIONE La concentrazione utilizzata è: Mm (generalmente 1.5 mM)

34 [Mg++] mM CONCENTRAZIONE DI MgCl 2 amplificato specifico

35 deossiNUCLEOTIDI TRIFOSFATI: dNTPs Base Azotata (Adenina, Timina, Citosina, Guanina, Uracile) DESOSSIRIBOSIO La concentrazione utilizzata è: 0.2 mM ciascuno (200uM) N.B. Usare dUTP ad una concentrazione 2-5 volte maggiore

36 attività 3 esonucleasica attività catalitica attività 5 esonucleasica DNA POLIMERASI (Taq polimerasi)

37 Enzima naturale Enzima ricombinante AmpliTaq rTth 5- 3 EXO attività catalitica DNA RNA dNTP modificati DNA POLIMERASI (Taq polimerasi)

38 attività catalitica 5 EXO DNA POLIMERASI (Taq polimerasi) Stoffel fragment più termostabile: DNA ricco di CG

39 Versione Modificata dell AmpliTaq DNA Polimerasi Stessa attività catalitica e termostabilità Lattività catalitica è attivata termicamente e progressiva Hot-start PCR 5 EXO attività catalitica DNA RNA dNTP modificati DNA POLIMERASI (Taq polimerasi) AmpliTaq GOLD

40 LE CONDIZIONI DI REAZIONE

41 DENATURAZIONE SEPARAZIONE DELLE DUE ELICHE DEL DNA TARGET 94-95°C per secondi mezzo di reazione (presenza di cosolventi) natura del DNA target denaturazione preliminare di 3-5 minuti

42 ANNEALING FASE PIU DELICATA DELLA PCR Calcolo della temperatura di annealing (Tm-5°C) La durata dipende dal tipo di strumento utilizzato Calcolo della temperatura di annealing: Uso di sofisticati algoritmi Uso della formula 2(A+T) + 4(C+G) provare empiricamente INCONTRO E IBRIDAZIONE DEI PRIMERS CON IL DNA TARGET

43 ESTENSIONE Lunghezza della sequenza amplificata Tipo di strumento impiegato Estensione finale di 5-10 minuti 72°C per secondi POLIMERIZZAZIONE DI NUOVE MOLECOLE COMPLEMENTARI AL DNA TARGET

44 Varia a seconda del numero di copie iniziali di DNA target e della sensibilità richiesta: 1 ug DNA genomico ( copie) 25 cicli copie 30 cicli copie 34 cicli 100 copie 38 cicli 10 copie 42 cicli NUMERO DEI CICLI N.B. Oltre un certo numero di cicli non si ottiene più un aumento del numero di amplificati, per ottenere una sensibilità maggiore ricorrere ad altri sistemi (nested-PCR)

45 ParametriCondizioni di reazione Buffer Taq polimerasiKCl 50Mm, tris-cloruro 10mM + MgCl 2 DNA target0,1-2 ug DNA o RNA (cDNA) Primers0,2-1 mM ( pmoli per reazione) MgCl20,05 e 5 mM dNTP0,2 mM ciascuno (200uM). Taq polimerasi0,1-4 U Totale miscela di reazione25 – 100 ul Denaturazione94-98°C Annealing37-72°C Estensione60-72°C Numero dei cicli25 – 40 I PARAMETRI DELLA REAZIONE DI PCR

46 Primer Dimeri pre-PCR mispriming Pre PCR OTTIMIZZAZIONE DELLA REAZIONE DI PCR: FORMAZIONE DI PRODOTTI ASPECIFICI

47 DNA ds DNA denaturato primers Taq polimerasi FORMAZIONE DI PRODOTTI ASPECIFICI NEI PRIMI CICLI DI AMPLIFICAZIONE

48 concentrazione Taq polimerasi HIGHLOW FORMAZIONE DI PRODOTTI ASPECIFICI NEI PRIMI CICLI DI AMPLIFICAZIONE

49 Disegno dei primer poco accurato Errata temperatura di annealing Concentrazione di MgCl 2 non ottimale OTTIMIZZAZIONE DELLA REAZIONE DI PCR: FORMAZIONE DI PRODOTTI ASPECIFICI durante la PCR Ottimizzazione dei parametri di amplificazione Hot-start PCR

50 TIPI DI PCR

51 -- NESTED - PCR DNA TARGET 5 3 Primo step: Primers Esterni Secondo Step: Primers Interni I AMPLIFICATO II AMPLIFICATO RIVELAZIONE ED ANALISI DEL PRODOTTO DI AMPLIFICAZIONE

52 PCR MULTIPLEX permette lanalisi di più target contemporaneamente vengono usati miscele di primers o primers degenerati

53 PCR in situ Il DNA o lRNA vengono amplificati direttamente nelle cellule e nei tessuti morfologicamente intatti

54 LIGASE CHAIN REACTION (LCR) ligasi termostabile primers legati primers senso primers antisenso il processo si ripete per 30 o più cicli primers legati: prodotti di LCR DNA stampo no amplificati LCR mismatch: mutazione puntiforme

55 TRANSCRIPTION MEDIATED AMPLIFICATION (TMA)


Scaricare ppt "TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici Dott. MASSIMILIANO BERGALLO Dipartimento di Sanità"

Presentazioni simili


Annunci Google