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Programmi di sequenziamento genomico nelle piante Arabidopsis Riso Pioppo Già completati Mais Pomodoro Soia ……etc.

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Presentazione sul tema: "Programmi di sequenziamento genomico nelle piante Arabidopsis Riso Pioppo Già completati Mais Pomodoro Soia ……etc."— Transcript della presentazione:

1 Programmi di sequenziamento genomico nelle piante Arabidopsis Riso Pioppo Già completati Mais Pomodoro Soia ……etc.

2 Analisi funzionale dei geni Mutagenesi inserzionale RNA Antisenso RNAi Diminuire lespressione (Knock out)

3 Mutagenesi inserzionale Mutagenesi inserzionale su larga scala

4 T-DNA tagging Trasposon tagging

5 Il trasferimento genico nelle piante Vettore biologico: Agrobacterium, virus Mediato da: Diretto: biolistico, microiniezione, etc

6 Agrobacterium tumefaciens e rhizogenes

7 Agrobacterium tumefaciens E un patogeno delle piante responsabile del tumore (la galla) La trasformazione delle cellule della pianta è conseguenza del trasferimento e dellintegrazione nel genoma nucleare della cellula target di una regione (T-DNA) del plasmide Ti (Tumor-inducing)

8 Lintegrazione del T-DNA nel genoma dellospite è casuale

9 NOS- pro NOS-t NPTII(Kan R ) CaMV35S gene X Vettore a T-DNA RB LB Trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens plasmide helper Trasforma senza indurre il tumore (disarmato)

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11 Piantine trsformanti (verdi; Kan R ) di Arabidopsis thaliana

12 Arabidopsis thaliana (pianta modello) il cui genoma è stato completamente sequenziato ( 2000) linee inserzionali (T-DNA) Arabidopsis Biological Stock Center (Ohio S.U.) Nothingham Arabidopsis stock center (NASC) Breve sequenza del DNA genomico fiancheggiante linserto permette di stabilirne la posizione nel genoma

13 Trasposoni

14 Barbara McClintock (1902 –1992) Ds dissociation (non autonomo); Ac Activator (autonomo)

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17 Ac: 4563 bp IR : sequenze ripetute (imperfette) terminali 11bp Un gene che codifica per la trasposasi (807 aa)

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19 Assegnare una funzione ai geni la sequenza del genoma: Individuare, clonare e caratterizzare geni (anche su larga scala) è disponibile non è disponibile Come può essere utilizzato il trasposon (e T-DNA tagging)

20 Trasposizione generalizzata Mu (mais) Trasposizione bersaglio specifica Ac/Ds (tutto il genoma) (una regione genomica)

21 70-90% degli elementi Mu si inserice nei geni le inserzioni si verificano tardivamente nelle cellule germinali si inseriscono con alta frequenza sia in loci associati che non associati e qui rimangono stabili e trasmissibili attraverso la linea germinale non vengono persi e continuano a replicarsi (saturation mutagenesis) Mu (mutator)

22 Elemento Mu

23 Rescue Mu Consiste in un plasmide inserito in un elemeto Mu non autonomo

24 Lc (Leaf color): fattore trascrizionale richiesto per la prod. antocianine pBluescript: plasmide batterico ad alto numero di copie viene cotrasformato con pAHC20 (resistenza al Basta) le linee cotrasformate devono esser incrociate con una linea che porta un MuDr attivo per potere trasporre.

25 Rescue Mu Accelerare la scoperta e la caratterizzazione di geni mutagenizzati con Mu che presentino un fenotipo di interesse Recupero del plasmide 5-20 Kb di DNA, fiancheggiante lelemento Mu, in forma plasmidica facilmente sequenziabile (non occorre costruire una libreria genomica del mutante)

26 Una nuova risorsa per costruire librerie batteriche di DNA genomico di Mais arricchito in sequenze eucromatiche Non solo inserzioni germinali, ma anche somatiche tardive (cellule della foglia) Difficilmente danno un fenotipo e difficilmente vengono trasmesse alla progenie

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