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Modelling crescita microbica. La crescita microbica Cosa è la crescita microbica? Valutiamo –Cellule totali (microscopio) –Corpuscoli (Coulter counter,

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Presentazione sul tema: "Modelling crescita microbica. La crescita microbica Cosa è la crescita microbica? Valutiamo –Cellule totali (microscopio) –Corpuscoli (Coulter counter,"— Transcript della presentazione:

1 Modelling crescita microbica

2 La crescita microbica Cosa è la crescita microbica? Valutiamo –Cellule totali (microscopio) –Corpuscoli (Coulter counter, OD) –Cellule vive (FACS, microscopio) –Biomassa (peso secco) –Cellule proliferanti (UFC) –Attività metabolica (NADH, ATP,…)

3 Biomassa Può esistere crescita disgiunta dalla duplicazione?

4 Modelli cinetici Utilità del modelling: una descrizione quantitativa dei processi cellulari permette lottimizzazione dei processi fermentativi. Resa e produttività sono due parametri misurabili, ma è molto più difficile predire come un cambio delle condizioni operative li possa modificare. La predizione è permessa da un modello matematico, ossia da una serie di relazioni tra le variabili del sistema. –Relazioni: equazioni matematiche, espressioni logiche –Variabili: agitazione, feed-rate, pH, temperatura, [S], [P], biomassa

5 Disegno del modello Dipende dalluso: decidere il numero di reazioni da considerare e la loro stechiometria Kinetic expressions: le velocità delle reazioni considerate dal modello dipendono dalle variabili. Mass balance equations: descrivono come la materia entra, viene trasformata ed esce dal volume considerato (bioreattore); descrivono come cambiano nel tempo le concentrazioni. Simulazione del processo (assegnare parametri) Comparazione dati sperimentali Fitting dei parametri sperimentali (minimizzare la somma dei quadrati degli errori)

6 Complessità modello Complessità descrizione metabolismo e comportamento asincrono Modelli non strutturati –biomassa Modelli strutturati –Volume cellulare, età –Compartimentazione reazioni; dettaglio reazioni enzimatiche Non strutturati Non segregati Non strutturati Segregati Strutturati Segregati Strutturati Non segregati Descrizione cellule Descrizione popolazione As simple as possible but not simpler

7 Modello più semplice di crescita Fissione batterica binaria in mezzo omogeneo –Generazione –Tempo di generazione Crescita asincrona, media dei tempi Modalità batch, fbatch e continua

8 Crescita in batch 4 fasi classiche Terminata la latenza, aumento della velocità di crescita fino alla v max Descrizione: numero di cellule o biomassa

9 Valutazione biomassa La massa aumenta con un processo autocatalitico. dX/dt= X = velocità di crescita specifica Volendo determinare, integriamo: X t =X 0 e t Passando ai logaritmi naturali: LnX t =LnX 0 + t

10 Calcolo Un grafico del logaritmo naturale della biomassa contro il tempo in fase esponenziale dà una linea retta con come coefficiente angolare. Se uso i log 10, il coefficiente angolare è uguale a /2,303

11 td = LN(2)/ Ad ogni divisione, il numero di cellule raddoppia partendo da un inziale N 0 N t =N 0 2 n n=(LN(N t )-LN(N 0 ))/LN(2) td = t/n = t LN(2)/(LN(N t )-LN(N 0 )) In crescita exp bilanciata dimensioni medie costanti, relazione tra numero di cellule e biomassa. Considerando che in un td la biomassa passa da x 0 a 2x 0 2x 0 =x 0 e td ; LN(2x 0 )=LN(x 0 ) + td ; td = LN (2) Numero di cellule

12 Velocità e rese Le velocità volumetriche di formazione prodotti e scomparsa substrati sono determinabili sperimentalmente Velocità specifiche (r i )sono ottenute normalizzando le volumetriche per la biomassa presente. Rese: quantità di substrato che viene recuperata in biomassa o prodotti. Definita come rapporto delle velocità specifiche. Y SX = /r s Y SP =r p /r s Indicatore ultimo della distribuzione dei flussi metabolici Attenzione al senso (s X). Y XS è la quantità di substrato convertito per unità di biomassa formata. RQ è la resa della CO 2 sullO 2 : rCO 2 /rO 2

13 BLACK BOX Una singola reazione riassume tutte le reazioni della cellula. Tutte le rese sono quindi costanti La velocità di consumo del substrato è allora r s =Y XS Anche la formazione del prodotto, il consumo di ossigeno, etc, sono proporzionali alla Come otteniamo lentrata in stazionaria? Una singola cellula di E. coli che si duplica ogni 20 in 43 ore occupa il volume della Terra, e in 45 ore ne eguaglia il peso

14 in relazione a S Per un substrato limitante, la velocità dipende dalla concentrazione solo entro certi limiti. Un modo popolare per descrivere questo comportamento è il modello di Monod: = max S/ (K s + S)

15 Maintenance La resa non è costante al variare delle condizioni di crescita. Metabolismo endogeno Pirt: maintenance (m s ), la resa può non essere costante r s = Y true XS +m s Y SX = /(Y true XS +m s ) A bassi valori di la resa in biomassa decresce perché una quota crescente di substrato è utilizzato per le necessità del mantenimento; se è alta m è trascurabile e si torna alla formula originaria. r ATP =Y XATP +m ATP

16 Mass Balances Combinare il modello cinetico con un modello del bioreattore. Accumulo= velocità di formazione + ingresso – uscita d(c s,i V)/dt = -r s,i xV + Fc f s,i -F out c s,i VcixVcix FcfiFcfi F out c i x

17 Mass Balances d(c s,i V)/dt=-r s,i xV + Fc f s,i -F out c s,i Dividendo per V: d(c s,i )/dt=-r s,i x + Fc f s,i /V-F out c s,i /V D = F/V dilution rate Fed batch: F out =0 Batch e continuo F=F out d(c s,i )/dt=-r s,i x + D(c f s,i - c s,i )

18 Batch dx/dt= x ; x(t=0)=x 0 dc s /dt=-r s x ; c s (t=0) = c s,0 Equazione diff primo ordine, si può calcolare la biomassa nel tempo. La biomassa si accrescerà nel tempo, consumando il substrato, in accordo con Monod, e landamento del substrato sarà in accordo con c s =c s,0 – Y XS (x-x 0 ) Poiché alla fine il substrato è 0: Y SX =(x finale -x 0 )/c s,0 Per definizione

19 Simulazione batch

20 Chemostato ( Ж ) d(c s,i )/dt=-r s,i x + D(c f s,i - c s,i ) dx/dt= x-Dx; dx/dt = ( -D)x =D x = Y SX (c f s -c s ): è possibile misurare precisamente la resa (la derivata (Ж)=0, Y SX = /r s ) c s =DK s /( max -D): la concentrazione del substrato limitante aumenta con D Calcolo maintenance: x = D (c f s,i - c s,i )/(Y true XS D +m s ), regressione lineare.

21 Fed batch d(c s,i V)/dt=-r s,i xV + Fc f s,i -F out c s,i D = dV/Vdt: se voglio mantenerlo costante feeding esponenziale: F out = 0 quando t=0d(xV)/dt = 0 xV ; xV=x 0 V 0 e t F(t)= Y XS 0 x 0 V 0 e t /(c f s -c s ) 0 : la specifica velocità che voglio mantenere

22 Esempio pratico: produzione di interleukina in Z. bailii Batch reactor Fed-batch reactor Variable Kinetic model Phases kinetic model Biomass G = max G/(G+ks G ) 0 = t t*Fed B B1 = A exp [(t A -t)/ X ] t A t 1 Glucose q G = G /Y X/G 0 t t 1 (Y X/G ) B = (Y X/G ) A exp(-(t/ G )) EtOH ( product ) (q E ) p = G Y E/X 0 t < t* EtOH ( substrate ) (q E ) S = E /Y X/E t t* IL-1 (q IL ) G = G Y IL/X 0 t < t* Fed A (q IL ) A = A (Y IL/X ) A 0 t t A (q IL ) E = E Y IL/X t t*Fed B (q IL ) B1 = B1 (Y IL/X ) B t A t 1 (Y IL/X ) B = (Y IL/X ) A exp (-t/ IL )

23 Esempio pratico: produzione di interleukina in Z. bailii Parameters used for simulations. ParametersValues Determination Batch maxG 0.28 h -1 experimental and ref. [15] maxE 0.02 h -1 by fitting Y X/G 0.18 (g g -1 ) experimental Y X/E 0.10 (g g -1 ) experimental Y IL/X 4.5 x10 6 (g g -1 ) experimental Y E/X 1.11 (g g -1 ) experimental k SG 15 (g l1) by fitting k SE 30 (g l1) by fitting Fed-batch (A) (Y X/G ) A 0.37 (g g -1 ) experimental (Y IL/X ) A 1 x 10 5 (g g -1 ) experimental Fed-batch (B) X 8.7 h by fitting G 102 h by fitting IL 37.2 h by fitting

24 Fase batch

25 Fase fed batch

26 Dove sta il problema?

27 Fase fed batch


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