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IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

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1 IL MITOCONDRIO

2 FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico nel quale costantemente si fondono e si dividono

3 PROTEINE DI FUSIONE OPA 1: Proteina dello spazio intermembrana avente attività GTPasica Mfn: proteina della membrana esterna con un dominio GTPasico e una regione Coiled coil PROTEINE DI FISSIONE Fis 1: Proteina della membrana esterna Drp1: Proteina citosolica e mitocondriale avente attività GTPasica PROTEINE COINVOLTE NELLA FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI

4 TESSUTI DEI MAMMIFERI ALTERATI DA DIFETTI NELLE PROTEINE DI FUSIONE

5 LA BIOGENESI DEL MITOCONDRIO Il mitocondrio contiene un proprio genoma e apparati distinti di replicazione, trascrizione e traduzione. Tuttavia lmtDNA codifica solo per un ridotto numero di proteine (13) mentre il resto è codificato dal DNA nucleare

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7 LE PROTEINE CODIFICATE DALLmtDNA SONO CONTENUTE NEI COMPLESSI RESPIRATORI

8 IL DNA MITOCONDRIALE DEI METAZOI Costituisce circa l 1% del genoma: ogni cellula contiene da 10 3 a 10 4 copie di mtDNA Codifica per 2 rRNA, 13 mRNA e 22 tRNA Si trova in strutture ricche di proteine dette nucleoidi

9 I nucleoidi rappresentano lunità dinamica ed ereditaria dellmtDNA Vertebrati : nucleoidi/cellula 2 a 6 nucleoidi / organello 2 a 15 molecole di mtDNA/nucleoide I NUCLEOIDI

10 PROTEINE ASSOCIATE CON I NUCLEOIDI NEI VERTEBRATI Proteine coinvolte nel mantenimento, replicazione e/o trascrizione dellmtDNA Proteine con funzione sconosciuta Tra le proteine contenute nel nucleoide alcune hanno un ruolo noto nel metabolismo dellmtDNA, altre non sono apparentemente collegate allmtDNA dato che svolgono un ruolo a se stante. Parziale NUCLEOIDI

11 Studi in cellule di lievito hanno portato alla proposta di un modello di rimodellamento del nucleoide secondo il quale in seguito a cambiamenti del metabolismo cellulare (es situazioni di stress) laconitasi perderebbe il cluster Fe-S e si riposizionerebbe sul nucleoide, contribuendo a stabilizzare lmtDNA RIMODELLAMENTO METABOLICO DEI NUCLEOIDI MITOCONDRIALI

12 MODELLO DI SEGREGAZIONE DEI NUCLEOIDI IN LIEVITO Attraverso contatti con proteine di membrana il nucleoide mitocondriale si collega al citoscheletro. In questo modo il nucleoide si muove con i mitocondri nelle cellule della progenie durante la divisione cellulare

13 IL DNA MITOCONDRIALE DEI METAZOI Costituisce circa l 1% del genoma: ogni cellula contiene da 10 3 a 10 4 copie di mtDNA Viene ereditato per via materna Viene riparato con scarsa efficienza Il processo di ricombinazione del DNA mitocondriale è poco efficiente Codifica per 2 rRNA, 13 mRNA e 22 tRNA Si trova in strutture ricche di proteine dette nucleoidi Nel mitocondrio esiste il fenomeno della eteroplasmia, ossia la presenza di più di un genoma mitocondriale nello stesso individuo

14 La mancanza di ricombinazione del DNA mit potrebbe far pensare che il genoma mit si comporti come un organismo asessuato aploide, per cui laccumulo di mutazioni deleterie potrebbe determinare lestinzione dellorganismo (Muller Ratchet). Uno di questi meccanismi è detto bottleneck o campionamento IL BOTTLENECK Invece esistono meccanismi specifici che prevengono questa possibilità

15 Il bottleneck rappresenta un esempio di replicazione rilassata del DNA mit per cui durante la citochinesi alcune molecole si replicano ed altre no. Durante i primi stadi dellovogenesi avviene un campionamento delle molecole di DNA mit, fino a circa 200/cellula Successivamente nellovocita primario il contenuto cellulare di mtDNA e di mitocondri aumenta considerevolmente fino a molecole di mtDNA/cellula. MECCANISMO DEL BOTTLENECK

16 Il campionamento (bottleneck) avviene durante lo sviluppo di un feto femmina destinato a diventare la madre nelle generazioni successive. Il campionamento avviene in modo casuale senza meccanismi di selezione positivi o negativi Mentre le cellule germinali primordiali non differiscono nel loro livello di eteroplasmia la drammatica segregazione dei genotipi mitocondriali che avviene durante lo sviluppo degli ovociti primari dà luogo ad un alta varianza intercellulare

17 Il campionamento dellmtDNA porterebbe alla formazione di individui Omoplasmici nei quali si sarebbero perse le mutazioni debolmente deleterie prima che esse si accumulino. Ciò eviterebbe il verificarsi del Muller ratchet Tuttavia le mutazioni che sfuggono a questa selezione che sono debolmente deleterie e che non vengono rimosse, sarebbero amplificate e potrebbero diventare omoplasmiche Questo è probabilmente il meccanismo per la patogenesi delle malattie mitocondriali ereditate per via materna CONSEGUENZE DEL BOTTLENECK

18 MODELLO ASINCRONO DI REPLICAZIONE DELmtDNA

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21 MODELLI COMPETITIVI DI REPLICAZIONE DELLmtDNA NEI MAMMIFERI Replicazione asincrona (Clayton) Replicazione Unidirezionale Sincrona (Holt 2000) Replicazione bidirezionale da siti multipli di inizio

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23 LA TERMINAZIONE PREMATURA DELLA REPLICAZIONE DELL mtDNA DIPENDE DAL SUO SITO DI INIZIO Lorigine localizzata in pos 57 è responsabile per il mantenimento dellmtDNA in condizioni di steady state mentre le altre due origini sarebbero richieste per il recupero dopo la deplezione dellmtDNA e per accellerare la replicazione dellmtDNA in risposta a richieste fisiologiche

24 La replicazione dellH-strand (modello Clayton) inizia nella regione non codificante e richiede la presenza di un primer ad RNA che è sintetizzato dalla RNA polimerasi mitocondriale a partire dal promotore P L. Il principale sito di inizio della replicazione si trova a livello di una sequenza conservata CSB-1 che rappresenta il punto più importante per la transizione tra lRNA primer e lmtDNA IL DNA MITOCONDRIALE UMANO

25 TAS RNA DNA CSBs 5 3 IL D-LOOP Una notevole proporzione di molecole di mtDNA di mammifero contiene una struttura a tripla elica detta D-loop, costituita da un breve tratto di strand H nascente appaiata alla strand L templato, con conseguente spiazzamento della strand H materna. Le estremità 3 del D-loop si trovano in corrispondenza di blocchi di sequenza conservate dette TAS E stato proposto che la struttura del D-loop rappresenti una replicazione abortiva e che il numero di copie dellmtDNA possa anche essere regolato dallespansione di questa struttura.

26 FATTORI COINVOLTI NELLA REPLICAZIONE DELL mtDNA La replicazione dellmtDNA dipende da numerosi fattori, ognuno dei quali svolge un ruolo importante nel processo.

27 SINTESI DEL PRIMER Richiede: mtRNA pol Fattori di trascrizioneTFAM TFB1 TFB2

28 TFAM Attiva la trascrizione delle strand H ed L legandosi ai rispettivi promotori HSP E LSP Si lega al DNA anche in maniera regolare e senza specificità di sequenza svolgendo la funzione di histone-like protein OH 2 OH CSB1 CSB3 CSB2 LSP HSP TFAM I TL I TH E essenziale per il mantenimento dell mtDNA in quanto la sua deplezione é letale

29 TFAM, TFB1 E TFB2 TFAM LSP TFB1 TFB2 TFB1 e TFB2 sono due fattori proteici che insieme a TFAM stimolano la sintesi del primer Sembra che TFB1 e TFB2 colleghino TFAM con lRNA polimerasi facilitando linizio della trascrizione mtRNA pol.

30 MATURAZIONE DEL PRIMER RICHIEDE UNA RIBONUCLEOPROTEINA (MRP) o AVVIENE IN MODO PROTEINA INDIPENDENTE

31 Lenzima MRP è unendonucleasi costituita da una parte proteica e da una componente ad RNA. Secondo gli autori lenzima svolgerebbe il suo ruolo tagliando lRNA e producendo il primer per la replicazione. Il taglio avverrebbe quando lRNA è ibridizzato con il DNA stampo formando una struttura R-loop

32 Lesistenza di strutture a singola strand nella regione CSB1 suggerisce che esse rappresentino dei siti di pausa della trascrizione. Pertanto la formazione del primer sarebbe indipendente dallazione di una nucleasi

33 Utilizzando un sistema purificato di trascrizione in vitro si è osservato che la trascrizione della strand L termina nel box CSB II. Pertanto anche questo studio sostiene che la formazione del primer è indipendente dalla presenza della endonucleasi MRP

34 LA TERMINAZIONE PREMATURA DELLA REPLICAZIONE DELL mtDNA DIPENDE DAL SUO SITO DI INIZIO Lorigine localizzata in pos 57 è responsabile per il mantenimento dellmtDNA in condizioni di steady state mentre le altre due origini sarebbero richieste per il recupero dopo la deplezione dellmtDNA e per accellerare la replicazione dellmtDNA in risposta a richieste fisiologiche

35 FATTORI COINVOLTI NELLA REPLICAZIONE DELL mtDNA

36 mtSSB Proteina che lega il DNA a singolo filamento evitandone la rinaturazione stimola lattività 3-5 esonucleasica e lattività 5-3 polimerasica della DNA polimerasi. ed aumenta anche la processività dellenzima Il collegamento tra espressione di mtSSB e variazioni nel contenuto dellmtDNA suggerisce che essa sia asssociata con meccanismi che regolano la replicazione o la stabilità dellmtDNA Studi in Drosophila mostrano che lespressione di mtSSB è regolata dal legame ad elementi DRE che controllano la replicazione del DNA di Drosophila. Ciò definisce un possibile legame tra replicazione nucleare e mitocondriale La deplezione di mtSSB induce la deplezione dellmtDNA ALTRE CARATTERISTICHE DI mtSSB

37 ELICASI E stata descritta una elicasi mitocondriale 5-3 richiesta per la replicazionedell mtDNA Lattività di TWINKLE è stimolata da mtSSB Mutazioni nel gene per TWINKLE sono associate con delezioni multiple nellmtDNA di pazienti sofferenti per ladPEO Studi con animali transgenici e esperimenti di RNAi hanno mostrato che lespressione di TWINKLE è strettamente associata con il livello dellmtDNA TWINKLE, mtSSB e TFAM sono localizzate nei nucleodi Essa è stata denominata TWINKLE (omologa alla elicasi- primasi di T7)

38 Le sequenze TAS potrebbero essere un segnale di riconoscimento per una DNA-binding protein che potrebbe funzionare bloccando la progressione della forca replicativa Questa proteina potrebbe svolgere un azione antielicasica COME VIENE REGOLATA LESTENSIONE DEL D-LOOP ? RNA DNA CSBs 5 3 IPOTESI TAS

39 Gli autori identificano una proteina di circa 45KDa che si lega alle regioni TAS A E TAS B del DNA mit umano

40 P.lividus mtDNA 12 S Cyt b ND5 ND6 F Q T E Q N C R mtDBP OHOH P mtDBP, THE D-LOOP BINDING PROTEIN IN SEA URCHIN

41 MtDBP works as a bidirectional transcription termination factor in an in vitro heterologous transcription assay. bmtDBP -- RO T T pDBP-term(F)pDBP-term(R) mt DBP IS A TRANSCRIPTION TERMINATION FACTOR

42 Is mtDBP involved in mtDNA replication, perhaps by impeding the synthesis of nascent DNA (contrahelicase activity) ? NCR STE OHOH QNPAT G-rich nascent H-strand RNA primer mtDBP AND mtDNA REPLICATION…….. mtDBP

43 Recombinant purified mtDBP G-rich mtDBP helicase substrates Partial duplex substrates that contain mtDBP binding site alone or followed by its flanking region, in both orientations IN VITRO HETEROLOGOUS HELICASE ASSAY SV40 large T Antigen (replicative helicase)

44 Substrate: mtDBP binding site OHOH DBP.For T Ag 5 3 * T Ag ++++ mtDBP 100 °C * * % helicase activity T Ag OHOH * DBP.Rev mtDBP * * % helicase activity T Ag 100 °C +- DNA-BOUND MTDBP EXHIBITS A NON-POLAR CONTRAHELICASE ACTIVITY

45 It terminates transcription bidirectionally It is a bidirectional contrahelicase that could act as a negative regulator of mtDNA synthesis. MTDBP IS A DUAL FUNCTION PROTEIN: MtDBP could coordinate the interplay between replication and transcription.

46 -block the replication fork in a polar mode (contrahelicase) -exert a polar stop to elongating RNA pol; passage of an RNA transcript from the permissive side of DNA-protein complex causes dislodging of the protein: the arrested helicase is restored. Bacterial factors Tus and RTP (D. Bastia and coll.): blocking side permissive side blocking side RNApol replic. RNApol replic. PROKARYOTIC FACTORS MEDIATING TERMINATION OF TRANSCRIPTION AND REPLICATION Blocked RNApol

47 What is the mechanism that allows mtDNA synthesis to resume? MODEL Dissociation of DNA-bound mtDBP caused by the passage, in the opposite direction, of the RNA polymerase through the protein-DNA complex.

48 T7 RNA pol T7 promoter T7 RNA pol transcribes and invades mtDBP-DNA complex mtDBP T7 promoter 32 P mtDBP is dislodged and trapped by a labelled DNA probe mtDBP DNA template mtDBP T7 RNA pol _ + _ ++ __ _ + _ _ + free oligonucleotide mtDBP/DNA complex _ _ DNA:prot. 1:61:13 NTPs + _ IMPACT OF TRANSCRIPTION INVASION ON THE DNA-BOUND MTDBP

49 Transcription invasion of the protein-DNA complex causes dislodging of mtDBP. The arrested helicase is restored and mtDNA replication can resume. Readthrough transcription dislodges mtDBP A POSSIBLE MODEL FOR THE ABROGATION OF mtDBP CONTRAHELICASE ACTIVITY mtRNA pol elongating H-strand 12SET P Q OHOH DNA helicase 12S arrested H-strand OHOH TEPQ mtRNA pol G-rich AT mtDBP

50 DNA POLIMERASI Nelle cellule animali la DNA polimerasi mitocondriale (DNA pol ) é una proteina costituita da due subunità: subunità catalitica con attività esonucleasica 3-5 ed attività polimerasica 5-3 di circa 140 kDa subunità regolatrice di kDa La subunità regolatrice è omologa alle aminoacil-tRNA sintetasi di classe II Essa aumenta laffinità della polimerasi per lmtDNA e promuove un più forte legame dei nucleotidi aumentando la velocità di polimerizzazione

51 REGOLAZIONE DEL NUMERO DI COPIE DEL DNA Il numero di copie del DNA può dipendere: da fattori direttamente coinvolti nella replicazione da fattori coinvolti nella biogenesi del mitocondrio da fattori coinvolti nel ciclo cellulare

52 REGOLAZIONE DELLA BIOGENESI MITOCONDRIALE

53 In risposta a danni al DNA, p53 interagisce con lmtDNA e con la DNA polimerasi aumentando la velocità di replicazione

54 MODELLO PER LA REGOLAZIONE DEL NUMERO DI COPIE DELLmtDNA DA PARTE DELLA VIA DI CONTROLLO Mec1/Rad 53 DEL CICLO CELLULARE

55 IL NUMERO DI COPIE DELL mtDNA DIPENDE DA FATTORI PROTEICI E DA ELEMENTI LIMITANTI COME IL POOL DEI NUCLEOTIDI

56 MAPPA DELLE MUTAZIONI PATOLOGICHE DEL DNA MITOCONDRIALE UMANO (DI MAURO 2005)

57 ASPETTI CLINICI, MORFOLOGICI E BIOCHIMICI DI DISORDINI COLLEGATI A MUTAZIONI DELLmtDNA

58 GENI NUCLEARI COINVOLTI NEL MANTENIMENTO DELLmtDNA

59 SOSTITUZIONI AMINOACIDICHE NELLA DNA POL RESPONSABILI DI MUTAZIONI PATOLOGICHE O DI POLIMORFISMI AdPEO Sporadic PEO Sindrome di Alper SANDO Male infertility Mutazioni autosomiche recessive


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