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1 La Cromatografia Prof. S. Consoli Prof. A. Percolla.

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Presentazione sul tema: "1 La Cromatografia Prof. S. Consoli Prof. A. Percolla."— Transcript della presentazione:

1 1 La Cromatografia Prof. S. Consoli Prof. A. Percolla

2 2 La Cromatografia è una tecnica di separazione n Essa trova impiego sia in che preparativo n Essa trova impiego sia in campo analitico che preparativo n Il nome cromatografia significa disegno colorato e deriva dalle esperienze iniziali effettuate dal botanico russo Tswett che impiegò il metodo per la prima volta allo scopo di separare i pigmenti colorati delle foglie.

3 3 Esperienza di Tswett n Una colonna di vetro è riempita con Al 2 O 3 in polvere (fase fissa) ed un solvente n in cima alla colonna si versa una soluzione di pigmenti. n Si procede quindi al lavaggio (eluizione) della colonna con un solvente (fase mobile) eluente (fase mobile) colonna cromatografica bande cromatografiche Al 2 O 3 riempimento Al 2 O 3 (fase fissa) (fase fissa) I II III

4 4 Esperienza di Tswett n man mano che si aggiunge solvente e procede leluizione n le bande si spostano verso il basso n finché si raccolgono nei vasi posti in basso eluente colonna cromatografica bande cromatografiche in cammino I II III

5 5 n Leluizione è quasi completa n Le bande I e II adesso sono uscite e sono state raccolte in due contenitori diversi n Per la sostanza III bisogna continuare leluizione. eluente colonna cromatografica la banda cromatografica III si è spostata in fondo alla colonna I bande cromatografiche già eluite I e II II III

6 6 La cromatografia è basata su quattro fenomeni fondamentali: n Adsorbimento n Ripartizione n Scambio ionico n Esclusione

7 7 Adsorbimento n E dovuto alle deboli forze di attrazione che esistono tra le molecole di un solido e quelle di un liquido (o di un gas) con cui il solido si trova a contatto. n Un esempio comune di adsorbimento si verifica tra il fumo di sigaretta e la lana dei vestiti o i capelli. n Ladsorbimento è un fenomeno reversibile infatti basta far arieggiare gli indumenti per attenuare lodore del fumo. infatti basta far arieggiare gli indumenti per attenuare lodore del fumo.

8 8 Adsorbimento n la quantità di adsorbato dipende dalla superfice di contatto tra il gas ed il solido. ma dipende anche dalla pressione del gas e dalla temperatura. Riscaldando il sistema le molecole di gas tendono a staccarsi dalla fase fissa

9 9 Equazione di Freundlich n Ladsorbimento è illustrato dallequazione di Freundlich C f = a P 1/n in cui :C f = conc. nella fase fissa P = pressione del gas a ed n dipendono dalla natura delle sostanze e dalla temperatura pressione CfCfCfCf saturazione In genere si scelgono le condizioni operative lontane dalla saturazione dove landamento è quasi rettilineo

10 10 Ripartizione n Si abbia un sistema costituito da due fasi L1 e L2 (es.: gas/liquido come aria e acqua oppure due liquidi non miscibilicomeacqua /olio) n Si abbia un sistema costituito da due fasi L1 e L2 (es.: gas/liquido come aria e acqua oppure due liquidi non miscibili come acqua /olio) n si aggiunga una terza sostanza S che sia solubile in entrambi i liquidi L1L1L1L1 L2L2L2L2 S in questa rappresentazione i puntini indicano le molecole di sostanza S ; le freccette invece indicano il movimento di queste tra le due fasi sino al raggiungimento dellequilibrio

11 11 Ripartizione Equaz. di Nernst n La sostanza S si scioglie ripartendosi tra le due fasi L 1 e L 2 secondo lequazione di Nernst C L 1 /C L 2 = K (costante) C L 1 = Conc di S in L 1 ; C L 2 = Conc di S in L 2 K = dipende dalle sostanze presenti e dalla temperatura. CL2CL2CL2CL2 CL1CL1CL1CL1

12 12 n Nelle colonne cromatografiche la ripartizione si realizza impregnando con una sostanza oleosa i microgranuli che riempiono la colonna Ripartizione sito di adsorbimento sito di ripartizione molecole di gas

13 13 Ripartizione /Adsorbimento n Come si vede sia il diagramma delladsorbimento a pag. 8 che quello della ripartizione a pag. 10 hanno lo stesso andamento. C mobile C f i ssa Per descrivere la separazione si preferisce quindi parlare di: concentrazione in fase fissa concentrazione in fase mobile A B

14 14 Separazione tra due sostanze A e B Come si vede la fase fissa trattiene la sostanza A con maggiore forza rispetto alla sostanza B Infatti C f A > C f B Quindi il gas oppure il solvente della fase mobile trascina la sostanza B mentre A resta indietro. C mobile C f i ssa A B

15 15 S cambio ionico n Alcune sostanze polimeriche hanno la proprietà di scambiare ioni H + oppure ioni OH - grazie alla presenza di particolari gruppi funzionali n n R--SO 3 H+ Na R--SO 3 Na + H + n n Una colonna cromatografica riempita con resina scambiatrice può separare sostanze ioniche

16 16 Esclusione o permeazione di gel n Una sostanza polimerica dispersa in un solvente può cadere o meno entro le porosità di un gel a seconda delle sue dimensioni. polimero di piccole dimensioni percorso Una molecola di piccole dimensioni ritarda nelluscire dalla colonna perchè penetra nei pori e compie un percorso più lungo GEL

17 17 Esclusione o permeazione di gel n Invece una molecola polimerica di grandi dimensioni trova difficoltà a penetrare nel gel e viaggia più velocemente lungo la colonna. polimero di grandi dimensioni GEL percorso

18 18 Le principali modalità di esecuzione di una cromatografia n in fase liquida (LC) u su carta u su colonna u su strato sottile (TLC) n in fase gassosa (GC) u su colonna a riempimento u su colonna capillare Un ulteriore metodo è la cromatografia in fase liquida ad alta pressione (HPLC )

19 19 Cromatografia su carta (ascendente) n Come supporto di adsorbimento o scambio ionico si usa una speciale carta da filtro. n Una goccia del campione viene depositata alla base del foglio ed asciugata. n Il foglio così preparato viene chiuso in una camera di vetro con un po di solvente sul fondo, in modo che il solvente tocchi la base de foglio n Il foglio viene imbevuto lentamente per capillarità. n Mentre il solvente sale i componenti vengono separati. standards di confronto standards di confronto campione

20 20 Cromatograia su strato sottile(TLC) n E analoga a quella su carta con la differenza che come supporto si usa il materiale di riempimento delle colonne. n La polvere usata per riempire la colonna viene depositata su una lastra di vetro, in forma di impasto in strato sottile. n I componenti sono separati ed identificati per confronto con sostanze note standards di confronto standards di confronto campione

21 21 Caratteristiche più appariscenti n Sia la cromat. su carta che la TLC consentono con attrezzature elementari di effettuare separazioni non distruttive su quantità inferiori al milionesimo di grammo, in condizioni operative blande. n I componenti possono essere recuperati ritagliando la carta oppure raschiando la polvere della lastra. n Se il composto non è colorato si può rivelare o mediante fluorescenza ai raggi UV oppure con reazioni chimiche che danno una reazione cromatica.

22 22 Cromatografia preparativa n La cromatografia su colonna può essere effettuata sia su scala analitica che su scala industriale. n In laboratorio si usano colonne con diametro 1-:-2 cm e lungh. di 20-:-30 cm n Su scala industriale si usano colonne con dimensioni 10 volte più grandi. n La cromatografia preparativa è importantissima nella separazione e purificazione di complesse sostanze naturali termolabili e con caratteristiche similari come enzimi, o proteine, ac. nucleici, immunopolisaccaridi,ormoni etc.

23 23 Gas Cromatografia n La condizione necessaria per la separazione gas-cromatografica è che le sostanze da analizzare siano facilmente vaporizzabili n 1/1000 di cc di Campione viene iniettato in un microevaporatore caldo, e quindi viene trascinato da una corrente di gas detto carrier. n La miscela gassosa passa quindi in una colonna ove avviene la separazione. n Un rivelatore posto alluscita invia un segnale elettrico ad un amplificatore e quindi ad un registratore grafico. colonna crom colonna cromatografica iniettore bombola carrier detector uscita dei gas registr. amplif.

24 24 Gas Cromatografia n Anche la colonna deve essere riscaldata per evitare la condensazione del campione n Come gas carrier si usano Idrogeno,oppure Azoto,oppureElio. n Come gas carrier si usano Idrogeno,oppure Azoto, oppure Elio. n La separazione cromatografica somiglia alla distillazione frazionata. n Quindi il potere separatore di una colonna cromatografica viene contraddistinta dal numero di piatti teorici Una colonna impaccata ha 5mm e lungh 3 -:- 5 m Una colonna impaccata ha 5mm e lungh 3 -:- 5 m Una colonna capillare ha mm e lungh 30-:- 100 m Una colonna capillare ha mm e lungh 30-:- 100 m registratore colonna cromatografica iniettore bombola carrier detector uscita dei gas amplificatore stufa termostatica

25 25 Rivelatori per G.C. n HWD :hot wire detector, in Inglese rivelatore a fili caldi n HWD è basato sulla differenza di conducibilità termica delle sostanza rispetto al carrier. n Una resistenza elettrica calda viene più o meno raffreddata al passaggio del gas. La resistenza varia il proprio valore e genera un segnale elettrico. n NellHWD quattro resistenze sono collegate a formare un ponte di Westone. Una delle resistenze è a contatto con il carrier puro mentre unaltra è a contatto con il gas in uscita. - + iniettore colonna cromat. uscita gas segnale - + resistenza

26 26 Rivelatori per GC n FID: Flame Ionization Detector ; in Inglese rivelatore a ionizzazione di fiamma. n Il gas in uscita dalla colonna viene immesso in una microfiamma H 2 /aria ove vengono bruciate le sostanze analizzate. n Nella combustione si formano frammenti molecolari dotati di cariche elettriche. Questi ioni posti in un campo elettrico danno luogo ad un segnale. aria Idrogeno carrier segnale

27 27 Segnale del detector e cromatogramma n Quando una sostanza esce dalla colonna incontra il detector. n Le molecola di una sostanza non escono tutte contemporaneamente, ma si comportano come una folla che percorre una strada. n Allinizio ci sono poche molecole, poi queste aumentano raggiungendo un massimo per poi diminuire sino a sparire. n il grafico ottenuto è detto picco cromatografico o cromatogramma tempo segnale Profilo del segnale

28 28 Segnale del detector e cromatogramma tempo segnale Profilo del segnale nel caso di un campione contenente 4 componenti

29 29 Analisi Qualitativa/Quantitativa in Cromatografia Analisi qualitativa n Stabilite le condizioni sperimentali, un composto è individuato dal tempo che la sostanza impiega a percorrere tutta la colonna (tempo di ritenzione) n Il tempo di ritenzione si misura tra il momento delliniezione ed il punto di massimo del picco cromatografico. Analisi quantitativa n La quantità di sostanza è proporzionale alla superfice del picco. n Il picco ha una forma curvilinea, ma per semplicità di calcolo si approssima ad un triangolo n Oggi esistono apparecchiature automatiche dette integratori che calcolano la superfice. n Per risalire alla concentrazione di ogni componente si calcola la superfice %ale di ogni componente, moltiplicata per un opprtuno coefficiente.

30 30 Analisi Qualitativa/Quantitativa in Cromatografia n Per l individuazione di una sostanza è necessario effettuare un confronto con la stessa sostanza allo stato puro n La sostanza di confronto è detta standard. n Per l individuazione di una sostanza è necessario effettuare un confronto con la stessa sostanza allo stato puro n La sostanza di confronto è detta standard. Analisi quantitativa n La risposta del detector è diversa per ogni sostanza. n La risposta del detector dipende dalle condizioni operative. n Per conoscere la quantità di un componente bisogna effettuare il confronto con una quantità nota di standard Analisi quantitativa n La risposta del detector è diversa per ogni sostanza. n La risposta del detector dipende dalle condizioni operative. n Per conoscere la quantità di un componente bisogna effettuare il confronto con una quantità nota di standard Analisi qualitativa

31 31 GC ISOTERMA n La gas cromatografia deve essere condotta in condizioni di temperatura controllata. n Se varia la temperatura variano sia il coeff di ripartizione che il coeff di adsorbimento. n Se variano i coefficienti varierà il tempo di ritenzione. Gas Cromatografia e temperatura GC a temperatura Programmata n Alcuni composti impiegano tempi molto lunghi per attraversare la colonna con conseguente diminuizione del potere separatore.. n Per abbreviare il tempo di analisi, si aumenta gradatamente la temperat. della colonna n in questo caso si parla di Temperatura programmata T= cost

32 32 Gas Cromatografia e temperatura GC isoterma. GC a temp. Programmata tempo Temperatura T= cost T in T fin

33 33 Gas Cromatografia a gradiente ( temperatura programmata) tempo Temperatura T in T fin 1) fase iniziale di preriscaldamento 2) Rampa aumento di temperatura a gradiente costante T/ t °C/min 3) fase finale di spurgo e pulizia della colonna. 4) raffreddamento e predisposizione per un nuovo ciclo( linea rossa ) rampa inizio fine raffreddamento

34 34 HPLC n High Pressure Liquid Chromatography in Inglese : cromatografia liquida ad alta pressione. in Inglese : cromatografia liquida ad alta pressione. n Per aumentare il potere separatore di una colonna si può u aumentare la lunghezza della colonna u aumentare la superfice di contatto rendendo la polvere di supporto più fina. n Quando si effettua la cromatografia su colonna in fase liquida, il liquido percola solo sotto lazione della gravità. n Se la polvere e troppo fina la gravità è insufficiente e la colonna si intasa. n Si ricorre quindi a pressioni elevate che possono arrivare a 400 atm

35 35 HPLC n Una tipica colonna per HPLC ha diametro di 3-:-4 mm e lungh. 10-:-20 cm n Il potere separatore delle colonne per HPLC supera facilmente piatti teorici, contro il migliaio delle colonne per gas-cromatografia lunghe alcuni metri. colonna crom colonna crom. iniettore detector uscita del liquido registr. amplif. pompa a siringa riserva di solvente carrier valvole filtro

36 36 Rivelatori per HPLC Spettrofotometrico UV n Il liquido in uscita viene posto sul cammino ottico di un raggio Ultra Violetto in un microspettrofotometro. n Quando passa una sostanza diversa dalleluente, varia lintensità della luce assorbita, che viene misurata da una fotocellula. RI : indice di rifrazione RI : indice di rifrazione n Lindice di rifrazione è un indicatore molto sensibile della composizione di una soluzione. n Quando passa una sostanza diversa dalleluente, varia lindice di rifrazione.Un raggio di luce viene deviato più o meno verso una fotocellula. Rivelatore conduttometrico Rivelatore conduttometrico: Se la sostanza da rivelare è di natura ionica, allora conduce la corrente elettrica e può essere rivelata da un conduttometro.

37 37 HPLC : complessità della strumentazione n Il solvente da usare deve essere di grande purezza e totalmente privo di gas n Per degasare il solvente si fa gorgogliare Elio nel solvente n La pompa è uno strumento di grande precisione dovendo garantire alte pressioni(20-:-200 atm) portata, programmabile costante con incrementi di 0,1 ml/min n La pompa è fatta di zaffiro n Alcuni strumenti hanno pompe a doppio corpo o due pompe per poter usare due solventi n Il solvente da usare deve essere di grande purezza e totalmente privo di gas n Per degasare il solvente si fa gorgogliare Elio nel solvente n La pompa è uno strumento di grande precisione dovendo garantire alte pressioni(20-:-200 atm) portata, programmabile costante con incrementi di 0,1 ml/min n La pompa è fatta di zaffiro n Alcuni strumenti hanno pompe a doppio corpo o due pompe per poter usare due solventi n n Liniettore è piuttosto complesso per evitare spruzzi di solventi ad alta pressione contro loperatore al momento dellintroduzione del campione Il rivelatore UV può rilevare lassorbanza solo su una fissa oppure tutto lo spettro di ogni sostanza in una frazione di secondo n n Il potere separatore altissimo produce diagrammi con picchi alti e stretti per la cui elaborazione è assolutamente necessario un integratore collegato ad un PC. n n Gli strumenti per HPLC sono quindi molto costosi e così anche i materiali di consumo n n Liniettore è piuttosto complesso per evitare spruzzi di solventi ad alta pressione contro loperatore al momento dellintroduzione del campione Il rivelatore UV può rilevare lassorbanza solo su una fissa oppure tutto lo spettro di ogni sostanza in una frazione di secondo n n Il potere separatore altissimo produce diagrammi con picchi alti e stretti per la cui elaborazione è assolutamente necessario un integratore collegato ad un PC. n n Gli strumenti per HPLC sono quindi molto costosi e così anche i materiali di consumo

38 38 Analisi qualitativa e quantitativa in HPLC n Tutte le considerazioni fatte prima per la cromatografia in fase gassosa ( tempo di ritenzione, forma e superfice del picco) sono valide anche per lHPLC. n Lanalsi si conduce a temperatura ambiente con un solvente degassato. n La presenza di bolle di gas anche microscopiche provoca dei falsi segnali. n Lanalsi si conduce a temperatura ambiente con un solvente degassato. n La presenza di bolle di gas anche microscopiche provoca dei falsi segnali.

39 39 HPLC e composizione del solvente. Eluizione isocratica n Lanalisi viene condotta mantenendo costante la composizione del solvente carrier n Isocratico = uguale miscela n Leluizione isocratica corrisponde in GC alla eluizione isoterma Eluizione isocratica n Lanalisi viene condotta mantenendo costante la composizione del solvente carrier n Isocratico = uguale miscela n Leluizione isocratica corrisponde in GC alla eluizione isoterma Eluizione a gradiente n n Lanalisi viene condotta variando la composizione della miscela di solvente carrier man mano che procede leluizione, n n Leluizione a gradiente corrisponde in GC alla eluizione a gradiente di temperatura. Eluizione a gradiente n n Lanalisi viene condotta variando la composizione della miscela di solvente carrier man mano che procede leluizione, n n Leluizione a gradiente corrisponde in GC alla eluizione a gradiente di temperatura.


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