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Verso il futuro con lingegneria genetica 5bio3. 1. Mantenere le cellule competenti di E.coli Ampicillina sensibili in ghiaccio, per un paio di minuti,

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Presentazione sul tema: "Verso il futuro con lingegneria genetica 5bio3. 1. Mantenere le cellule competenti di E.coli Ampicillina sensibili in ghiaccio, per un paio di minuti,"— Transcript della presentazione:

1 Verso il futuro con lingegneria genetica 5bio3

2 1. Mantenere le cellule competenti di E.coli Ampicillina sensibili in ghiaccio, per un paio di minuti, prima dellaggiunta del DNA plasmidico. Per ogni trasformazione batterica usare 50μl di cellule competenti.

3 2. Aggiungere 50 ng di DNA plasmidico (pGEX- KT con resistenza allampicillina) alle cellule e incubare in ghiaccio per 30min. Effettuare un controllo negativo senza aggiungere DNA plasmidico ai 50 μl di cellule.

4 3. Incubare le cellule a 42 °C per 40sec (shock termico) per far in modo di dilatare i pori della membrana e facilitare lentrata del DNA plasmidico nella cellula batterica.

5 4. Incubare le cellule in ghiaccio per 2min in modo tale da richiudere i pori della membrana.

6 5. Aggiungere alle cellule batteriche 250 μl di LB fresco(senza antibiotico) e incubare in agitazione a 37 °C per 40min. Si fanno crescere le cellule su un terreno normale. Si effettua lincubazione a 37 °C per 40min perché serve alle cellule per riprendersi dopo lo shock termico, iniziare un ciclo di replicazione e permettere lespressione del gene per la resistenza allampicillina

7 6. Allestire delle piastre con il terreno LB agarizzato contenente 50 g/mL di ampicillina. Mettere in piastra di LBagar+AMP volumi differenti di sospensione cellulare e cioè: - 5 μl di cellule trasformate - 10 μl di cellule trasformate - 50 μl di cellule trasformate μl di cellule trasformate Piastrare anche: - 20 μl di cellule senza aggiunta di DNA plasmidico su piastre LBagar+AMP(controllo negativo) - 20 μl di cellule senza aggiunta di DNA plasmidico su piastre LB agar (controllo positivo: in assenza di ampicillina si verifica la crescita di E.coli e si valuta la qualità delle cellule competenti.

8 7. Distribuire le cellule sulla superficie del terreno usando una spatola sterile ad L. 8. Incubare a 37°C per 24 ore. 9. Osservare le piastre delle cellule trasformate seminate in LB agar + Amp e contare le colonie per poter calcolare lefficienza di trasformazione. Osservare le piastre dei controlli.


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