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Ipossia e danno neuronale: studio sperimentale COMPOSIZIONE UNITÀ DI RICERCA Virginia Tancredi, Professore Associato, Fisiologia Giovanna DArcangelo, Ricercatore.

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1 Ipossia e danno neuronale: studio sperimentale COMPOSIZIONE UNITÀ DI RICERCA Virginia Tancredi, Professore Associato, Fisiologia Giovanna DArcangelo, Ricercatore Universitario, Fisiologia Margherita DAntuono, Assegnista di ricerca, Fisiologia Roberto Forcina, contrattista, Fisiologia Francesco Antonelli, Biologo Molecolare e Presidente dellAIAS di Sgurgola (Frosinone).

2 E utile la ricerca? Lutilità della ricerca è fin troppo evidente. La ricerca ha bisogno di tempo, la sua utilità non è immediata. La ricaduta della ricerca biomedica sulle strategie terapeutiche si può evidenziare anche dopo decenni.

3 La ricerca si muove attorno a processi che non si conoscono obbligandoci di volta in volta a scegliere, tra più alternative possibili, qual è la strada giusta da seguire. La strada può sembrare più lunga ma magari ci farà arrivare alla meta, le scorciatoie nella ricerca non sono opportune. Lutlità della ricerca si paleserà in un secondo momento. Le scoperte effettuate potranno essere utili in più campi rispetto a quelli ipotizzati allinizio.

4 Il danno cerebrale ipossico-ischemico prenatale e perinatale è il fattore maggiormente responsabile della mortalità e morbilità di neonati e bambini che spesso porta a ritardo mentale, epilessia, difficoltà di apprendimento e disabilità motorie.

5 La patogenesi di questo danno è complessa dal momento che è correlata ad una cascata di eventi tossici tempo-dipendenti che includono: (i)rapida deplezione dei magazzini intracellulari di adenosintrifosfato (ATP) (ii)glicolisi anaerobica, acidosi da acido lattico, e depolarizzazione della membrana cellulare (iii)eccitotossicità da glutammato (iv)aumento dellentrata di calcio, sodio e acqua nelle cellule con conseguente rigonfiamento (v)attivazione di enzimi calcio-stimolati (vi)attivazione del sistema immunitario (vii) iperespressione di particolari geni (viii) morte neuronale.

6 Questi eventi sono simili a quelli descritti nellictus cerebrale del paziente adulto, ma la gravità con cui questi danneggiano il cervello immaturo, è profondamente influenzata dalletà fetale in cui il avviene levento ipossico. Infatti, la suscettibilità del SNC immaturo allipossia/anossia, è dipendente dallo stato dei processi di sviluppo critici quali la proliferazione, migrazione, differenziazione, mielinizzazione, così come dalla regolazione del flusso sanguigno cerebrale e dal metabolismo.

7 In molte aree del Sistema Nervoso Centrale (SNC) di mammifero, utilizzando preparati biologici che consistono in fettine di cervello mantenute in vita in vitro quali quelle di corteccia somatosensoriale, talamo-corticali o di ippocampo-corteccia entorinale dove vengono conservate le connessioni dei circuiti nervosi, è possibile, tramite registrazioni elettrofisiologiche studiare gli effetti dellipossia. Durante levento ipossico i neuroni e le cellule gliali vanno incontro ad una severa ed improvvisa depolarizzazione inducendo una risposta che viene definita depolarizzazione ipossica (HD), che si verifica entro pochi minuti dal blocco sinaptico

8 Questa risposta può rappresentare uno dei passi iniziali che porta alla morte cellulare ed è caratterizzata: dalla cessazione dellattività neuronale, da un improvviso shift negativo nel potenziale extracellulare, da una severa depolarizzazione dei neuroni e della glia e da una drastica ridistribuzione di ioni ai lati della membrana. Dopo la riossigenazione la trasmissione sinaptica non si ripristina se la depolarizzazione ipossica dura più di qualche minuto contribuendo quindi ad un danno cellulare acuto in regioni particolarmente sensibili allipossia come ad esempio la regione CA1 dellippocampo. Quindi il blocco irreversibile della trasmissione sinaptica dopo ipossia acuta è un importante indice fisiologico del danno.

9 E stato dimostrato che lischemia cerebrale è accompagnata da una marcata reazione infiammatoria, dovuta ad un aumento di espressione delle citochine, di molecole di adesione e di altri mediatori infiammatori, inclusi i prostanoidi e lossido nitrico. Studi preclinici suggeriscono che lintervento precoce per attenuare tale infiammazione riduce la progressione del danno cerebrale.

10 Gli obiettivi principali del nostro studio sono: Obiettivo #1: In questa parte del progetto si sono utilizzati e si utilizzeranno ratti tra P0 e P21 sottoposti a danno anossico/ischemico e si sono effettuate e si effettueranno registrazioni intra/extracellulari da fettine di ippocampo per valutare gli effetti delle citochine sulla trasmissione sinaptica e sul potenziamento tetanico a lungo termine. Progetto di Ricerca

11 Obiettivo #2: In una seconda serie di esperimenti si effettueranno registrazioni elettrofisiologiche da fettine di ratti sottoposti a danno anossico/ischemico secondo le modalità convenzionali dove la madre sia stata pre-trattata in vivo con citochine per valutarne leventuale effetto protettivo sul danno post- ischemico. Le fettine utilizzate per le registrazioni elettrofisiologiche potranno essere utilizzate in unulteriore fase di questo progetto di ricerca per effettuare studi molecolari e istochimici. Questo studio ci permetterà di valutare limportanza dellintervento tempestivo nei casi di anossia perinatale e soprattutto studiare i meccanismi cellulari coinvolti nella progressione neuropatologica del danno post-ischemico per poter intervenire con le terapie adeguate.

12 Nel tessuto nervoso sono stati identificati recettori per le citochine accoppiati ad una stimolazione dei processi di fosforilazione intracellulare della tiroxina e della serina/treonina, e alcune di queste citochine hanno un effetto modulatorio sui fenomeni di plasticità sinaptica. Infatti, alcune citochine inibiscono lespressione del potenziamento a lungo termine (LTP) considerato un correlato elettrofisiologico di apprendimento e memoria, mentre altre lo aumentano. A questo proposito occorre ricordare che mentre la maggior parte delle citochine determinano unazione infiammatoria, è stato dimostrato che linterleuchina 6 (IL-6) ha al contrario un effetto protettivo sul tessuto cerebrale. Infatti, durante lo sviluppo IL-6 promuove laccrescimento assonale e la differenziazione neuronale in colture, un azione sinergica con il fattore di accrescimento neuronale (NGF), ma distinta in termini di segnali di trasduzione intracellulari coinvolti. Perché le citochine

13 Abbiamo recentemente dimostrato che IL-6 ha un effetto inibitore sul rilascio di glutammato e conseguentemente sulla propagazione delleccitazione attraverso la corteccia cerebrale, un evento che suggerisce il ruolo protettivo di IL-6 sulla sopravvivenza neuronale dopo insulto traumatico o ipossico. E quindi importante continuare ad esplorare lefficacia delle terapie antiinfiammatorie nel trattamento del danno postischemico. Risultati generali

14 Risultati -Lanossia induce sui neuroni dellippocampo una depolarizzazione duratura. -Il periodo di riperfusione sembra essere quello più critico che può portare a morte cellulare. Durante questo periodo i potenziali sinaptici risultano di ampiezza maggiore. Possiamo individuare 2 possibili meccanismi: -lincremento del rilascio di neurotrasmettitori e lattivazione dei recettori degli amminoacidi eccitatori (EAA)i, in particolare quelli di tipo NMDA -laccumulo di Ca2+ intracellulare -Durante linterruzione di ossigeno, così come durante il periodo di riperfusione, aumenta anche il rilascio di GABA, ma non è ancora chiaro come e perché le conduttanze GABA-mediate possano contribuire alla depolarizzazione post- anossica. N.B. Come è noto il GABA è coinvolto nellinibizione sinaptica e quindi lattivazione dei recettori GABAa dovrebbe iperpolarizzare i neuroni, quindi contrapporsi allazione depolarizzante degli EAA. Possiamo, quindi, pensare che il rilascio di GABA, durante lanossia, possa rappresentare un mecanismo protettivo contro leccitotossicità.

15 Effetto dellanossia sulla trasmissione di base registrata simultaneamente dalla zona dei corpi cellulari e dai dendriti della regione CA3 dellippocampo

16 Differenti risposte allanossia dei corpi cellulari e dei dendriti

17 Effetto dellanossia sullattività epilettica indotta in vitro dalla 4-aminopiridina Potenziale GABA-mediato Fase ictaleFase interictale

18 Prospettive future Studio dei meccanismi responsabili dellatrofia muscolare, conseguente alla spasticità Eventuale loro prevenzione Studio di strategie innovative di riabilitazione per il recupero neuromotorio. Studio del ruolo delle citochine antiinfiammatorie sugli effetti indotti dallanossia


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