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Glicogenosi tipo 1a: trasferibilità dei dati sperimentali al trattamento del paziente AIG Rimini 2010 Luigi Varesio.

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Presentazione sul tema: "Glicogenosi tipo 1a: trasferibilità dei dati sperimentali al trattamento del paziente AIG Rimini 2010 Luigi Varesio."— Transcript della presentazione:

1 Glicogenosi tipo 1a: trasferibilità dei dati sperimentali al trattamento del paziente AIG Rimini 2010 Luigi Varesio

2 Dal laboratorio alla clinca Fase 1 Fase 1 Sperimentazione in vitro e su modelli animali Sperimentazione in vitro e su modelli animali preparazione dei reagenti per lutilizzo sulluomo preparazione dei reagenti per lutilizzo sulluomo Fase 2 Fase 2 Approvazione del protocollo dai comitati etici (Ospedale, Ministero della Sanità) Approvazione del protocollo dai comitati etici (Ospedale, Ministero della Sanità) Certificazione dei reagenti per sperimentazione sulluomo Certificazione dei reagenti per sperimentazione sulluomo Fase 3 Fase 3 Sperimentazione della terapia sul paziente Sperimentazione della terapia sul paziente

3 Terapia cellulare GSD1a Trapianto di epatociti

4 TRAPIANTO DI EPATOCITI MATURI Insufficienza epatica acuta Causa (N° pazienti trattati) outcome Droghe (19) (19) 14 deceduti 2 trapiantati 3 guariti Infezione virale (9) (9) 6 deceduti, due trapiantati, 1 guarito Insufficienza epatica acuta idiopatica (6) (6) 2 deceduti, 3 trapiantati, 2 guariti Avvelenamento da funghi (1) (1)Guarito Insufficienza epatica acuta idiopatica post- operatoria (1) (1)Deceduto

5 TRAPIANTO DI EPATOCITI MATURI Malattie Metaboliche malattia(N°pazienti) Risultati al follow up outcome Crigler-Najjar(9) Miglioramento dei parametri metabolici Tutti trapiantati (ecceto uno) da 4 mesi a 4 anni dal trattamento Ipercolesterolemia familiare (5) Miglioramento dei parametri metabolici NA Deficienza del fattore VII (2) Riduzione della richiesta del fattore VII dell70% per 6 mesi Trapianto dopo 7-8 mesi Glicogenosi tipo 1a (2) Miglioramento dei parametri metabolici NA Colestasi intraepatica familiare (2) Nessun beneficio Trapianto dopo 5-14 mesi Deficienza di OTC (6) 4 pazienti con miglioramento dei parametri metabolici. 2 pazienti deceduti 4 pazienti trapiantati da 4 a 7 mesi dal trattamento Deficienza di ASL (1) Miglioramento dei parametri metabolici Trapianto dopo 18 mesi Deficienza di CPS1 (1) Miglioramento dei parametri metabolici In attesa di trapianto dopo 11 mesi dal trattamento Citrullinemia (1) (1) Miglioramento dei parametri metabolici NA

6 TERAPIA CELLULARE NEL FEGATO: STAMINALI TERAPIA CELLULARE NEL FEGATO: STAMINALI Ben tollerate e poco invasive Sperimentazione nel topo

7 Modello di topo sano glicogenotico Terapia con staminali della glicogenosi 1a fegato Cellule staminali ematopoietiche Iniezione nel fegato di cellule staminali derivate dal midollo osseo

8 a b c 20 m d h f g e 2500 m 100 m Ripopolazione del fegato con cellule staminali ematopoietiche ottenute da vari ceppi di topi Ripopolazione del fegato con cellule staminali ematopoietiche ottenute da vari ceppi di topi -galanti- -galcontrollo anti- -gal Istochimica per attività G6PasiFISHFluorescenza GFPepatocita Alb GFP topi Rosa-26 Topi GFP

9 Non trattati Trattati v.t. Trattati i.f. Trattati i.e. % vivi Giorni dal trattamento Il trattamento con cellule staminali aumenta la sopravvivenza dei topi glicogenotici

10 CONCLUSIONI Cellule ematopoietiche staminali possono essere importanti per correggere i difetti enzimatici del fegato di pazienti con Glicogenosi di tipo 1a CONCLUSIONI Cellule ematopoietiche staminali possono essere importanti per correggere i difetti enzimatici del fegato di pazienti con Glicogenosi di tipo 1a Trapianto di cellule ematopoietiche staminali

11 CELLULE STAMINALI MIDOLLARI PER RIPOPOLAMENTO DEL FEGATO Cirrosi epatica Paese N° pazienti Tipo di cellule infuse Risultati ottenuti al follow-up follow-up (mesi) Italia8 mobilitazione con G- CSF 1 Miglioramento parametri clinici 8 Giappone9 Staminali derivate dal midollo Miglioramento parametri clinici 6 Iran4 Staminali ematopoietiche derivate dal midollo Nessun miglioramento parametri clinici 6 Iran4 Staminali mesenchimali derivate dal midollo Miglioramento parametri clinici 12 Brasile10 Mononucleate totali Nessun miglioramento parametri clinici 4 Brasile30 Mononucleate totali Miglioramento parametri clinici 3 Grecia2 Mononucleate totali Miglioramento parametri clinici 12 Inghilterra5 CD34+ dopo adesione su plastica 2 Miglioramento parametri clinici 12 Germania6CD133+ NA Germania 3 13CD133+ Miglioramento parametri clinici NA

12 I DIECI PRINCIPI DELLE GOOD MANUFACTURING PRACTICE LE NORMATIVE EUROPEE

13 Cell factory

14 LA GESTIONE DEL SISTEMA DI QUALITÀ Il personale -Le figure indispensabili: - Qualified Person - Responsabile Produzione -Responsabile Controllo Qualità La documentazione * La gestione della documentazione * Le standard operating procedures * I protocolli Il change control Le deviazioni Out of specification e out of trend nei laboratori di controllo qualità La gestione delle azioni correttive e preventive I reclami ed i richiami Le auto ispezioni La certificazione dei lotti

15 LA PRODUZIONE Descrivere i flussi dei materiali in conformità alle normative GMP Descrivere i flussi di processo in conformità alle normative GMP Gli ambienti e le apparecchiature I sistemi di condizionamento Le utilities * Acqua * Vapore * Gas * ecc… La qualifica e le sue fasi La convalida di processo Il mantenimento dello stato di qualifica e convalida * Calibrazione * Manutenzione * Riqualifica

16 IL CONTROLLO QUALITÀ Ruoli e competenze Le attività di laboratorio * Metodi di analisi * La qualifica della strumentazione * La convalida dei metodi di analisi lL campionamento LE GESTIONE DELLE ATTIVITÀ A CONTRATTO Il Technical/Quality Agreement La qualifica del fornitore

17 Necrotic foci, elevated chemokines and infiltrating neutrophils in the liver of glycogen storage disease type Ia. Kim DY et al, J Hepatol Necrotic foci, elevated chemokines and infiltrating neutrophils in the liver of glycogen storage disease type Ia. Kim DY et al, J Hepatol La glicogenosi 1a può essere associata ad uno stato infiammatorio

18 Glicogenosi tipo 1 a Manifestazioni cliniche epatomegalia ipoglicemia iperuricemia iperlipidemia ritardi di crescita Complicazioni mancata crescita ritardo puberta gotta giovanile pancreatite arteriosclerosi epatoma ipertensione adenoma malattie renali zuccheri grassi proteine G6Pase Infiammazione Citochine IL-6, IL-8 Che cosa causa linfiammazione?

19 No VHL normale No VHL Il gene della sindrome Von Hippel Lindau (VHL) normaleNo G6Pasi

20 Hypoxia causes inflammation Years ago: 3.8 billion first procariotic fossil 2.0 billion photosynthetic organisms Oxygen captured by ferrous iron Earth rusted 1.8 billion first eucariotic organism Hypoxic Atmosphere (1% oxygen) 0.6 billion animal evolution Normoxic Atmosphere ( 20% oxygen) Years ago: 3.8 billion first procariotic fossil 2.0 billion photosynthetic organisms Oxygen captured by ferrous iron Earth rusted 1.8 billion first eucariotic organism Hypoxic Atmosphere (1% oxygen) 0.6 billion animal evolution Normoxic Atmosphere ( 20% oxygen) physiologic pathologic

21 HIF-1 Pathway HIF-1 P P P P OH pVHL HIF-1 P P OH HIF-1 P P OH Ub HIF-1 Proteosomal degradation Ubiquitinatio n NORMOXIA Prolyl- Hydroxylation Ub HYPOXIA Stabilization HIF-1 P P P P P P P P P P P P P P P P Hydroxylation Stabilization HRE HIF-1 P P CBP/ p300 Transcription cofactors HRE HIF-1 P P CBP/ p300 Transcription cofactors x No VHL

22 Hypoxia in patho-physiological processes HYPOXIA (pO mm Hg) Growing tumors Cerebral ischemia Myocardial ischemia Pulmonary hypertension Rheumatoid arthritis Diabetic retinopathy Wound healing Preeclampsia Intrauterine growth retardation Energy metabolism Cell proliferation/ survival Angiogenesis Cell survival Cell migration Erytropoiesis Microbial infections Aherosclerosis

23 Ipossia Glicogenosi 1a Cè ipossia nel fegato glicogenotico?

24 Il mondo dell omica

25

26 54000 probsets The chip

27 PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA IN GSD1a Analisi tramite tecnologia microarray del: Profilo di espressione genica nel fegato di TRE pazienti GSD1a trapiantati rispetto a TRE soggetti normali Bibliosphere (Genomatics) nuovo programma per analizzare le vie metaboliche modificate nei tessuti Analisi tramite tecnologia microarray del: Profilo di espressione genica nel fegato di TRE pazienti GSD1a trapiantati rispetto a TRE soggetti normali Bibliosphere (Genomatics) nuovo programma per analizzare le vie metaboliche modificate nei tessuti

28 Ipossia nel fegato di pazienti con glicogenosi 1a NAME 23 GENI OXP HYPOXIA_REG_UP LINES_MYC_LEA NB-HYPO_32 GENES L1L2_11PBST HYPOXIA_RCC_NOVHL_UP L1L2_M- V$HIF1_Q3 HYPOXIA_NORMAL_UP HIF1_TARGETS L1L2_M+ TRP_U133 HYPOXIA_REVIEW V$HIF1_Q5 HYPOXIA_RCC_UP LEA_C1_SET_TOP NAME HSA00190_OXIDATIVE_PHOSPHORYLATION HSA00330_ARGININE_AND_PROLINE_METABOLISM HSA01040_POLYUNSATURATED_FATTY_ACID_BIOSYNTHESIS HSA00272_CYSTEINE_METABOLISM HSA00360_PHENYLALANINE_METABOLISM HSA00010_GLYCOLYSIS_AND_GLUCONEOGENESIS HSA00020_CITRATE_CYCLE HSA00910_NITROGEN_METABOLISM HSA00252_ALANINE_AND_ASPARTATE_METABOLISM HSA00030_PENTOSE_PHOSPHATE_PATHWAY HSA04610_COMPLEMENT_AND_COAGULATION_CASCADES HSA00220_UREA_CYCLE_AND_METABOLISM_OF_AMINO_GROUPS

29 O2O2O2O2 CC-chemokine receptors Gro-chemokines Monocyte trapping Circulation Monocyte Hypoxic tissue Mn migration inhibiting factor (MIF) G-protein deactivator (RGS1) Motility-promoting factor (ENPP2) CXC-Chemokines Neutrophils recruitment

30 Necrotic foci, elevated chemokines and infiltrating neutrophils in the liver of glycogen storage disease type Ia. Kim DY et al, J Hepatol Necrotic foci, elevated chemokines and infiltrating neutrophils in the liver of glycogen storage disease type Ia. Kim DY et al, J Hepatol Che cosa provoca queste risposte? LIPOSSIA DEL FEGATO

31 Glicogenosi tipo 1 a Manifestazioni cliniche epatomegalia ipoglicemia iperuricemia iperlipidemia ritardi di crescita Complicazioni mancata crescita ritardo puberta gotta giovanile pancreatite arteriosclerosi epatoma ipertensione adenoma malattie renali zuccheri grassi proteine G6Pase Infiammazione Citochine IL-6, IL-8 Che cosa causa linfiammazione? LIPOSSIA DEL FEGATO

32 Quali sono le criticità?

33 Trattamento B iobanca I ntegrata T essuto-genomica ( BIT ) Gaslini Pazienti Strutture DNA Espressione Genica RNA regolatori Strutture DNA Espressione Genica RNA regolatori Classificazione Patologia Diagnosi Classificazione Patologia Diagnosi Clinica Fattori Prognostici Indicatori risposta Clinica Fattori Prognostici Indicatori risposta Biobanca Raccolta tessuto omics Arrays Derivati del Tessuto Derivati del Tessuto Frazionament tessuto Integrazione Bioinformatica Dati clinici Datti: centinaia di migliaia DNA, RNA, Proteine, distribuzione conservazione DNA, RNA, Proteine, distribuzione conservazione Raccolta, conservazione, Distribuzione tessuto Raccolta, conservazione, Distribuzione tessuto BANCA DATI BIT Ricerca: Data mining Biomarcatori Vie Metaboliche Ricerca: Data mining Biomarcatori Vie Metaboliche

34 DiBi BIT Biobanca Digitale Europea (DiBi) aggrega varie BIT Centralizzazione dellinformazione e non dei tessuti/sieri

35 CollaboratoriCollaboratori Biologia Molecolare Gaslini Biologia Molecolare Gaslini R. LavieriR. Lavieri A. EvaA. Eva P. FardinP. Fardin R.ResazR.Resaz L. VaresioL. Varesio Biologia Molecolare Gaslini Biologia Molecolare Gaslini R. LavieriR. Lavieri A. EvaA. Eva P. FardinP. Fardin R.ResazR.Resaz L. VaresioL. Varesio National Institutes of Health (USA) J.ChouJ.Chou D. MunroeD. Munroe S.K. AryaS.K. Arya National Institutes of Health (USA) J.ChouJ.Chou D. MunroeD. Munroe S.K. AryaS.K. Arya IST Genova O. BarbieriO. Barbieri IST Genova O. BarbieriO. Barbieri Associazione Italiana Glicogenosi Reparti Clinici Dr. M. Di Rocco Dr. M. Di Rocco G.Gaslini Institute (Genova) G.Gaslini Institute (Genova) Dr. D. Melis Dr. D. Melis Federico II University (Napoli) Federico II University (Napoli) Dr. R.Parini Dr. R.Parini S.Gerardo Hospital (Monza)S.Gerardo Hospital (Monza) Dr. S. Paci Dr. S. Paci S.Paolo Hospital (Milano)S.Paolo Hospital (Milano) Dr. E. Procopio Dr. E. Procopio Meyer Hospital (Firenze)Meyer Hospital (Firenze) Dr. C. Dionisi Dr. C. Dionisi Bambin Gesù Hospital (Roma)Bambin Gesù Hospital (Roma) Reparti Clinici Dr. M. Di Rocco Dr. M. Di Rocco G.Gaslini Institute (Genova) G.Gaslini Institute (Genova) Dr. D. Melis Dr. D. Melis Federico II University (Napoli) Federico II University (Napoli) Dr. R.Parini Dr. R.Parini S.Gerardo Hospital (Monza)S.Gerardo Hospital (Monza) Dr. S. Paci Dr. S. Paci S.Paolo Hospital (Milano)S.Paolo Hospital (Milano) Dr. E. Procopio Dr. E. Procopio Meyer Hospital (Firenze)Meyer Hospital (Firenze) Dr. C. Dionisi Dr. C. Dionisi Bambin Gesù Hospital (Roma)Bambin Gesù Hospital (Roma)

36 Haematopoietic stem cells

37 Hematopoiesis in the red bone marrow

38 MODELLI ANIMALI PER GLICOGENOSI 1A In preparazione Modello animaleCaratteristicheCostruttore Topi condizionaliKnock-out (SV40-CRE)Chou, J. (pubblicato) Topi condizionaliDelezione della G6Pasi solo nel rene Chou, J. (nessuna informazione) Topi condizionaliKnock-out (CMV.CRE) Varesio. I knock-out muoiono tutti alla nascita Topi condizionaliDelezione della G6Pasi solo nel fegato Varesio. Stanno nascendo i primi topi Topi condizionali???Fabienne RAJAS Gilles Mithieux. Nessuna informazione Nulla di pubblicato.

39 MODELLI ANIMALI PER GLICOGENOSI 1A Utilizzati finora Modello animale Tipo di terapia utilizzata RisultatiCostruttore Topo knock- out AdenovirusControllo parziale della patologia per breve tempoChou, J. Adenovirus + adenoassociato Controllo parziale della patologia per medio tempo con miglioramento anche sul rene Chou, J. Adenoassociato di nuova costruzione Controllo completo della malattiaChou, J. 2 Cane knock- out 1 Modello animale spontane o per la GSD-Ia. AdenoassociatoControllo parziale della patologiaKoeberl DD (NC) 3 Cane knock- out Modello animale spontane o per la GSD-Ia. AdenoassociatoControllo parziale della patologiaMah CS (FL) 4 e Chou, J


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