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Laurea in Medicina e Chirurgia Anno accademico 2011-2012 Biochimica/biologia molecolare clinica e diabete Prof. Fabrizio Barbetti.

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2 Laurea in Medicina e Chirurgia Anno accademico Biochimica/biologia molecolare clinica e diabete Prof. Fabrizio Barbetti

3 Il diabete mellito Definizione e tipi di diabete mellito. Cenni sul controllo fisiologico dei livelli ematici del glucosio. Ia biochimica clinica nella diagnosi del diabete mellito. Il diabete monogenico e la sua diagnostica La biochimica clinica nel controllo metabolico e nella valutazione delle complicanze

4 Definizione di diabete mellito Un gruppo di disordini metabolici eterogenei dal punto di vista clinico e genetico caratterizzati da elevati livelli ematici di GLUCOSIO Nella classificazione corrente si distinguono due tipi principali di diabete: il tipo 1 (T1D, distruzione immuno-mediata delle cellule pancreatiche). il tipo 2 (T2D, conbinazione di insulino resistenza e deficit insulinico risultanti sia da fattori genetici che ambientali). T1D + T2D: >95% dei casi

5 Il controllo fisiologico dei livelli ematici del glucosio Il glucosio ematico è regolato entro limiti stretti. Il controllo fisiologico della glicemia è -tra laltro- finalizzato al mantenimento di livelli minimi di glucosio durante la fase di digiuno notturna. 1H-C=O 2H-C-OH 3 OH-C-H 4H-C-OH 5H-C-OH 6 CH 2 OH D-Glucosio

6 Gluconeogenesi Glicogenolisi Isola pancreatica Insulina Glucagone Somatostatina FEGATO MUSCOLO SCHELETRICO TESSUTO ADIPOSO Glucosio mg/dl Glicemia

7 Gluconeogenesi Glicogenolisi Isola pancreatica Insulina Glucagone Somatostatina FEGATO MUSCOLO SCHELETRICO TESSUTO ADIPOSO Glucosio mg/dl Glicemia 2+

8 La soglia renale I livelli plasmatici di glicemia raggiunti i quali si satura il meccanismo di riassorbimento del glucosio a livello del tubulo renale: mediamente attorno a 180 mg/dl. Primo dosaggio affidabile della glicemia su sangue intero: Folin-Wu (1920). Primi inibitori della glicolisi: 1931.

9 I primordi della biochimica clinica: il dosaggio (!?!) della glicosuria nella diagnosi di diabete Diagnosi rara nell 800: su circa ricoveri al Massachussets General Hospital tra il , solo in 172 casi (0,004%) venne emessa diagnosi di diabete. Metodo analitico: far assaggiare al medico interno le urine del paziente.

10 Dosaggio della glicemia: raccolta e conservazione del campione Il dosaggio del glucosio in laboratorio è effettuato su siero o plasma (il sangue intero è utilizzato nellautocontrollo domiciliare e fornisce valori più bassi del 12-15%). Poiché la glicolisi diminuisce la concetrazione di glucosio ad un tasso del 5-7%/h a temperatura ambiente, si aggiungono al prelievo inibitori della glicolisi come il sodio fluoruro (NaF), in grado di stabilizzare i livelli di glucosio per almeno 3 giorni a temperatura ambiente ed un anticoagulante (ossalato di potassio).

11 Diabete tipo 2: rilevanza della diagnosi T2D= circa 90% di tutti i casi. Insorge tipicamente > 50 anni di età ed ha una elevata morbidità e costo sociale. Laumento della prevalenza di T2D correla con laumento dellobesità % degli individui con T2D sono asintomatici ed inconsapevoli della malattia. Liperglicemia asintomatica può precedere di molti anni (fino a 10) lesordio clinico e correla con il rischio cardiovascolare. Una significativa percentuale di pazienti con T2D (ca. 20% negli USA) presenta retinopatia diabetica alla diagnosi.

12 Le complicanze alla diagnosi come indicatore di malattia silente: la retinopatia La retinopatia diabetica può essere presente alla diagnosi e correla con gli anni di malattia. Estrapolando i dati è evidente che il diabete tipo 2 può essere presente almeno 6.5 anni prima dei sintomi clinici (e oltre !).

13 Diabetes ( ): passare attraverso 1964: il WHO stabilisce/propone i primi criteri diagnostici mediante il carico orale di tolleranza GLUCOSIO (OGTT). In Giappone: Shoukachi ovvero malattia della sete. Primi del 900: test di tolleranza al RISO

14 Carico orale di glucosio (OGTT): modalità. OGTT standard: 75 g di glucosio (disciolto) per os e prelievi al tempo 0 ed ogni 30 per 2 ore. Da effettuarsi solo se la glicemia a digiuno NON abbia già valore diagnostico. Casi speciali. Screening del diabete gestazionale: minitest (50 g), prelievi a 0 e 60. Se >140 mg/dl a 60, OGTT con 100 g. Bambini < 40 Kg: 1.75g per Kg di peso corporeo.

15 Diabete mellito: criteri diagnostici ADA* e WHO § Criteri ADA*/WHO§ Sintomi classici di diabete e un valore di glicemia venosa plasmatica casuale =/> a 200 mg/dl (*, §). Glicemia a digiuno >126 mg/dl (per 2 volte) (*, §). Glicemia =/>200 mg/dl al tempo 120 dellOGTT (§, [*]). Categorie a rischio: IGT (alterata tolleranza al glucosio): coloro che hanno una glicemia plasmatica a 120 dellOGTT >140 e <200 mg/dl (§, [*]). IFG (alterata glicemia a digiuno): coloro che hanno una glicemia a digiuno >100** e <126 mg/dl (*). ** RIVISTO NEL 2003 (precedente >110)

16 Criterio di scelta della glicemia a digiuno diagnostica di diabete da parte degli esperti ADA Il valore di 126 mg/dl è stato scelto come equivalente in termini di sensibilità e specificità al valore di 200 mg/dl a 120 dellOGTT.

17 Uso o non uso dellOGTT nella diagnosi di diabete: conseguenze pratiche

18 Cambiamento di prevalenza: non solo un problema metodologico Boston, Campione: circa persone. USA 2000 (stima WHO): Messico 2000 (stima WHO): Italia 2000 (stima WHO): Prevalenza diabete: 0.52 % USA 2030 (stima WHO: Messico 2030 (stima WHO): Italia 2030 (stima WHO):

19 Il diabete tipo 1 Il T1D è una malattia autoimmune organo specifica caratterizzata dalla distruzione delle cellule beta pancreatiche mediata dai linfociti T. Esordisce tra linfanzia e la pubertà, ma nessuna età è risparmiata. Lesordio clinico è spesso brusco, con forte dimagramento, poliuria, iperglicemia elevata accompagnata da chetosi.

20 Gli autoanticorpi circolanti confermano la diagnosi clinica Islet Cell Antibodies (ICA) Glutamic Acid Decarboxylase Antib. (GADA) Insulinoma-associated protein 2 Antib. (IA-2A) Insulin autoantibodies (IAA) ZnT8 autoantibodies (ZnT8A)

21 Ruolo degli autoanticorpi per la predizione del T1D Il dosaggio degli autoanticorpi nei parenti di primo grado di soggetti con T1D combinato con la valutazione delle secrezione insulinica è un valido predittore di insorgenza di T1D. Circa il 3-5% dei pazienti clinicamente T1D sono negativi al dosaggio degli autoanticorpi.

22 Elevata percentuale di malattia celiaca nei pazienti con T1D % dei pazienti con T1D hanno la malattia celiaca, confermata con biopsia intestinale. Di questi, circa il 70% sono sintomatici. IgA antiendomisio (EmA) o anti-TG2 (sensib.>90%, spec.>95% Se IgA tot. IgG antigliadina (AGA)

23 GENETICA del T1D e T2D Entrambe malattie poligeniche (nessun andamento di tipo mendeliano) Geni maggiori del T1D: 1) HLA; 2) VNTR del gene INS Geni maggiori del T2D: polimorfismi del gene TCF7L2, moltissimi altri

24 Glic.= 132 Età= 31 anni Scoperta= 24 aa Terap.=Dieta = Normale = mutazione GCK La famiglia GCK/MODY 2 Glicemia= 118 Età= 6 anni Glicemia= 130 Età= 3 anni Glic.= 143 Età= 65 anni Scoperta = 39 aa Terapia=Dieta Complicanze=NO

25 Le mutazioni GCK/MODY 2 (1) Il gene della glucochinasi (GCK) è uno dei sette geni noti che causano un sottotipo monogenico di diabete mellito denominato MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young). Il MODY si definisce come una condizione autosomica dominante in cui il diabete -non di tipo 1- insorge prima dei 25 anni di età.

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27 Le mutazioni GCK/MODY 2 (2) Le mutazioni della glucochinasi sono relativamente frequenti quando ricercate in una casistica pediatrica. Liperglicemia è modesta e NON progredisce nel tempo. La diagnosi molecolare derime i dubbi nei famigliari del bambino portatore ed è utile per lindirizzo terapeutico e della valutazione delle complicanze.

28 Il diabete tipo 1: un esempio clinico. Bambino di 14 anni con recente perdita di peso, poliuria, polidipsia, alito acetonico Glicemia a digiuno: 318 mg/dl Chetoni nelle urine: presenti (Ketostix +++, semiquantitativo= mg/dl) Diagnosi clinica: diabete tipo 1. E una diagnosi corretta ?

29 Il dosaggio degli autoanticorpi nel sospetto clinico di T1D in soggetti ad elevata familiarità ICA Decarbossilasi dellacido glutamico (GAD 65 ) Islet antigen 2 (IA-2) Insulina (IAA) = Diabete mellito ad esordio precoce (<40 anni) = Sospetto T1D Ab - probabile MODY3/HNF 1 Ab + T1D

30 Mutazioni MODY 3/HNF-1 : possibili meccanismi di iperglicemia Topo HNF-1 -/-. Ridotta espressione genica nella cellula di: 1) Ins-1 (ma non Ins-2) 2) Glut 2, GK 3) Ipf-1/Pdx-1 4) NeuroD, HNF-4

31 Efficacia delle solfaniluree nei paz. MODY 3 Deterioramento della HbA1c-> 10.3% dopo cambio per metformina Perdita di peso - 5.3kg Ripristinata Glibenclamide 5mg HbA1c 5.3% Pearson et al. Diab Med 2000

32 Casi sporadici con insorgenza nei primi 6 mesi di vita:diagnosi ? Neonato che alla terza giornata di vita esordisce con glicemia 400 mg/dl, chetoacidosi Peso alla nascita: g Familiarità per diabete: nessuna

33 K IR 6.2 SUR1 K+K+ Glucose ATP/ADP Ca 2+ [Ca 2+ ] i VDCC K ATP independent or augmentation pathway - prolonged 2 nd phase insulin release K ATP channels and insulin secretion regulation pulsatile insulin release _ + + K ATP channel activity + K ATP dependent or triggering pathway produce 1 st phase insulin release KCOs sulphonylureas Ca v 2.3

34 Insulin weaning and transfer to SU in patients with KCNJ11 mutation MUTAge at switch Dose mg/kg/d HbA1c TX: Ins HbA1c TX: SU Dur. TX SU C-peptide nmol/L R50P 10a, 6m m0.23 V59M17m m0.2 V59M28m m0.3 V59M 9a, 1m m0.39 R201C22m m0.12 R201H6m m0.2* R201H7m m0.2 R201H23m m0.7* V59M 9a m0.06 K170R 8a, 6m m0.21 mean Tonini,…Barbetti, Diabetologia 2006

35 Casi sporadici e non con insorgenza nei primi 6 mesi di vita:diagnosi ? Neonato che al terzo mese di vita esordisce con glicemia 500 mg/dl, chetoacidosi Peso alla nascita: g Familiarità per diabete: un genitore con diabete diagnosticato entro i primi due anni di vita

36 MALWMRLLP L L WLALLAGPDPAAFVN E H LAELHSGCL G REGCVLY F F Y T P K T R EAEDLEVGQVELGGGPG A S G NCYN LQ R E Q QYLISTCC GQKR PLA L L S E G C A V I V SL E COOH NH 2 s=s Signal peptide B-chain C-peptide A-chain Insulin precursor P L H PC-2

37 WT (PRO)INSULIN

38 R65C (PRO)INSULIN

39 nd-PS/1: C-peptide values 70, 90, 150 and 350 days after discovery of hyperglycemia

40 Gli old-days della biochimica clinica nel controllo metabolico: la soglia renale I livelli plasmatici di glicemia raggiunti i quali si satura il meccanismo di riassorbimento del glucosio a livello del tubulo renale: mediamente attorno a 180 mg/dl.

41 Rilevanza della HbA 1c come marcatore di rischio delle complicanze microvascolari DCCT (T1D): -35% del rischio di progressione della retinopatia diabetica ad ogni decremento del 10% (ad es. da 8 a 7.2%) della HbA 1c UKPDS (T2D): -35% di rischio di progressione delle complicanze microvascolari ogni decremento di 1 punto percentuale (ad es. da 9 a 8%) della HbA 1c

42 Biotecnologia di ritorno: luso della HbA1c a fini diagnostici (2009) HbA1c> 6.5%=diabete Vantaggi: modeste variazioni intraassay, nessuna necessità di digiuno, stabile a RT Svantaggi: risultati spuri in caso di condizioni che influenzano la vita media dei globuli rossi.

43 La nefropatia diabetica Insorge nel 35-45% dei casi con T1D Insorge nel 20-35% dei casi con T2D 1 a causa di insufficienza renale e trattamento dialitico. Insorge solitamente dopo anni di malattia, ma può essere più precoce. Se accertata nelle sue prime fasi, può regredire Marcatore precoce la microalbuminuria

44 Il ruolo della biochimica clinica nella valutazione della nefropatia diabetica. 1)Laumento di escrezione urinaria di albumina (UAE) è un marcatore di alterazione microvascolare. 2) Una UAE aumentata è -a volte- presente nei pazienti con diabete tipo 2 alla diagnosi. 3) UAE > 20 g/min è un fattore di rischio di sviluppare una nefropatia diabetica clinicamente evidente. 4) UAE nei soggetti con diabete tipo 2 è un predittore indipendente di aterosclerosi e mortalità cardiovascolare.

45 Microalbuminuria: definizione Valori compresi tra 30 e 300 mg/24 ore La terminologia NON si riferisce ad una isoforma particolare di albumina, ma al fatto che i livelli di UAE non sono rilevabili dai comuni metodi colorimetrici con stick (in grado di misurare concentrazioni >200 mg/L), pur essendo i valori al di sopra della norma (<30 mg/24 ore).

46 Microalbuminuria: quando, come. Nei soggetti con T1D a partire da 5 anni dalla insorgenza della malattia. Controlli successivi con cadenza annuale. Nei soggetti con T2D alla diagnosi e successivamente con cadenza annuale. Metodi quantitativi: Dosaggio radioimmunologico. Sensibile e preciso. ELISA (sandwich).

47 Microalbuminuria: problemi La UAE aumenta con: -lesercizio fisico -lipertensione arteriosa -la posizione eretta -liperglicemia --> necessità di standardizzare la raccolta del campione.


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