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RICERCA DEI MICOBATTERI NEL SANGUE Linfezione tubercolare I micobatteri vengono liberati nellaria, allinterno di goccioline di saliva (droplet nuclei),

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2 RICERCA DEI MICOBATTERI NEL SANGUE

3 Linfezione tubercolare I micobatteri vengono liberati nellaria, allinterno di goccioline di saliva (droplet nuclei), dai soggetti affetti da tubercolosi polmonare I droplet <5μm rimangono a lungo in sospensione nellaria e, se inalati, possono raggiungere gli alveoli polmonari Negli alveoli i micobatteri vengono fagocitati dai macrofagi non attivati ma riescono a moltiplicarsi al loro interno uccidendoli Il processo flogistico e lattivazione dei macrofagi riescono, nella grande maggioranza dei casi, ad arginare linfezione con formazione del processo primario Nel 5% dei casi si instaura la malattia tubercolare (primaria) La tubercolosi (post-primaria) può manifestarsi, nel 5% degli infetti, per riattivazione del processo primario in seguito allabbassamento delle difese immunitarie

4 Il Mycobacterium tuberculosis nel sangue Una breve fase batteriemica può aversi durante linfezione primaria allorché alcuni micobatteri possono passare nel torrente circolatorio, per via linfatica, e raggiungere i distretti più disparati Una fase batteriemica prolungata si ha nelle forme disseminate (tubercolosi miliare)

5 Le micobatteriosi Le infezioni da micobatteri non tubercolari si acquisiscono dallambiente La via di ingresso può essere respiratoria o alimentare La malattia si instaura soltanto in presenza di fattori predisponenti fra le quali il principale è labbassamento delle difese immunitarie Forme più comuni: –respiratoria (terza età) –linfoghiandolare (infanzia) –intestinale (AIDS) –disseminata (AIDS) Nella forma disseminata si ha micobatteriemia prolungata

6 Breve storia dellemocoltura per micobatteri 1917 M. C. Clough. The cultivation of tubercle bacilli from circulating blood in miliary tuberculosis. Am.Rev.Tuberc. 1932L. Shapiro. The frequency of bacillemia in tuberculosis. Am.Rev.Tuberc. 1935K. A. Jensen. Report on investigations regarding the Loewenstein technique of culturing tubercle bacilli from blood. Acta Tuberc.Scand. 1980W. Landau, J. Feczko, and R. L. Kaplan. Radiometric detection of mycobacteria in routine blood cultures. J.Clin.Microbiol. 1983J. L. Elliott, W. L. Hoppes, M. S. Platt, J. G. Thomas, I. P. Patel, and A. Gansar. The acquired immunodeficiency syndrome and Mycobacterium avium-intracellulare bacteriemia in a patient with hemophilia. Ann.Intern.Med. 1984L. Srtockman, G. D. Roberts, and D. M. Ilstrup. Effect of storage of the Du Pont lysis-centrifugation system on recovery of bacteria and fungi in a prospective clinical trial. J.Clin.Microbiol. 1988M. B. Agy, C. K. Wallis, J. J. Plorde, L. C. Carlson, and M. B. Coyle. Evaluation of four mycobacterial blood culture media: BACTEC 13A, Isolator/BACTEC 12B, Isolator/Middlebrook agar, and a biphasic medium. Diagn.Microbiol.Infect.Dis.

7 Il prelievo Campione di sangue –direttamente nel flacone solo con i flaconi dedicati ai micobatteri problema dei flaconi radioattivi –in assenza di flaconi dedicati in provetta (almeno 5 ml) con eparina in provetta con SPS Numero di prelievi –tre, preferibilmente in giorni diversi e prima dellinizio della terapia; ininfluente il momento del prelievo Conservazione del prelievo –a temperatura ambiente, anche per alcuni giorni

8 Diagnostica delle micobatteriemie Esame microscopico (inutile) Esame colturale –primi approcci rudimentali –semina dopo lisi-centrifugazione –semina diretta in terreno liquido dedicato Amplificazione genica (problematica)

9 La lisi-centrifugazione Anticoagulante SPS, saponina Centrifugazione per 30 min Aspirazione e scarto del supernatante Semina del sedimento su: –terreno solido (possibilità di conta) –terreno liquido o bifasico

10 I terreni liquidi per emocoltura Semina diretta –BACTEC 13A –BacT ALERT MB Blood –BACTEC MYCO/F Lytic permette anche lisolamento dei miceti Semina previa lisi-centrifugazione –Middlebrook 7H9 –BACTEC 12B –BacT ALERT MP Process –ESP Myco

11 I sistemi automatici BACTEC 460TB –radiometria: liberazione di CO 2 radiomarcata MB/BacT Alert 3D –refrattometria: variazione dellintensità luminosa di un raggio in seguito alla riflessione su un sensore di CO 2 BACTEC, serie 9000/F –fluorimetria: emissione di fluorescenza da parte di un sensore di O 2 ESP II –pressometria: rilevamento della diminuzione di pressione conseguente al consumo di O 2

12 Sintesi delle procedure di laboratorio 1 Eventuale trasferimento nel flacone da emocoltura Incubazione per 60 gg. o fino al momento della positivizzazione In caso di positività strumentale –preparato microscopico, per mettere in evidenza microorganismi alcol-acido resistenti in caso di positività del vetrino, semina su terreno specifico per micobatteri –semina su terreno non specifico per micobatteri e non selettivo, per evidenziare eventuali contaminazioni –ripresa dellincubazione in caso di negatività del preparato e della coltura

13 Test di ibridizzazione mediante DNA-probe sulle colonie micobatteriche cresciute nella subcoltura –M. tuberculosis complex identificazione biochimica a livello di specie antibiogramma –identificazione come micobatterio non tubercolare appartenente ad una delle 15 specie di più frequente isolamento –identificazione come micobatterio non tubercolare non appartenente a nessuna delle 15 specie di più frequente isolamento identificazione a livello di specie mediante HPLC o test biochimico-colturali Sintesi delle procedure di laboratorio 2

14 Emocolture non negative Fra campioni segnalati come positivi dallapparecchio automatico sono incluse –le vere positività –le contaminazioni –le false positività transitorie

15 Interpretazione dei risultati Non essendo i micobatteri presenti sulla cute, in caso di positività dellemocoltura per micobatteri, la contaminazione del campione non è ipotizzabile ed anche un solo isolamento è da ritenersi significativo

16 Emocolture per micobatteri eseguite negli ultimi 12 anni

17 Percentuali di positività

18 Mycobacterium avium complex

19 Mycobacterium tuberculosis

20 Altri micobatteri

21 Tempi di positivizzazione, in settimane

22 Cinetica di crescita di alcune specie micobatteriche

23 Infezioni micobatteriche e livello dei linfociti CD4 + M. tuberculosis MAC

24 Considerazioni sulla nostra casistica Le prime micobatteriemie sono comparse con qualche anno di ritardo rispetto agli USA Nei primi anni si isolava quasi esclusivamente il M. tuberculosis Repentina impennata dei MAC negli anni centrali dellultimo decennio del secolo scorso Nessun ritardo, per lisolamento di altre specie micobatteriche, rispetto ad altri paesi Con lintroduzione degli inibitori delle proteasi, gli isolamenti di MAC, peraltro già in flessione, sono quasi scomparsi Ancora tutta da valutare linattesa impennata di isolamenti dellultimo anno

25 Coltura del sangue mestruale Sistema di elezione per la diagnosi di annessiti tubercolari Raccolta sterile problematica Alte percentuali di contaminazioni

26 Conclusioni Dopo gli incrementi vertiginosi degli anni 90 la richiesta sembrava essersi stabilizzata; nellultimo hanno ha presentato però un brusco incremento La percentuale di positivizzazione oscilla attorno al 1% Probabilmente cè spazio per una riduzione delle richieste, ma lutilità dellemocoltura per micobatteri non è in discussione Gli isolamenti di M. avium sono stati drasticamente ridimensionati dai progressi nella terapia anti-retrovirale Gli isolamenti di M. tuberculosis sono rimasti pressoché invariati Gli isolamenti di altre specie sono diventati eccezionali Non è possibile prescindere dallimpiego di terreni liquidi La consuetudine di eseguire il test su tre campioni non sembra giustificata L incubazione dovrebbe essere prolungata fino ad otto settimane


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