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Università di Catania Dipartimento di Scienze Biomediche - Sezione Embriologia Medica - Corso di Istologia ed Embriologia – polo B - Testi Consigliati:

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Presentazione sul tema: "Università di Catania Dipartimento di Scienze Biomediche - Sezione Embriologia Medica - Corso di Istologia ed Embriologia – polo B - Testi Consigliati:"— Transcript della presentazione:

1 Università di Catania Dipartimento di Scienze Biomediche - Sezione Embriologia Medica - Corso di Istologia ed Embriologia – polo B - Testi Consigliati: Istologia di V. Monesi Ed. Piccin Larsen - Embriologia Umana - Ed. Gnocchi o Barbieri - Carinci – Embriologia – Casa Editrice Ambrosiana Dr. Imbesi Rosa 1

2 Materia Vivente Materia Vivente= Tutto ciò che ha la capacità di riprodursi o di replicarsi UNITA DI MISURA DI LUNGHEZZA:UNITA DI MISURA DI LUNGHEZZA: - micrometro m) = mm - nanometro (nm) = m - Angstrom (Å) = nm UNITA DI PESO:UNITA DI PESO: - milligrammo (mg) = g - microgrammo ( g) = g - nanogrammo (ng) = g - picogrammo (pg) = g DaltonDalton = unità di massa molecolare Corrisponde al peso dellatomo di idrogeno considerato come unità 2

3 LIVELLI DI ORGANIZZAZIONE DELLA SOSTANZA VIVENTE Virus, viroidi e prioni Procarioti Eucarioti pluricellulari Batteri Alghe unicellulari Protozoi Protofiti atomo aminoacidi Proteina globulare ribosoma virus batterio Cellula animale Cellula vegetale 3

4 CELLULA La più piccola unità vivente Cellule Cellule + matrice extracellulare TESSUTO ISTOLOGIA Porzione di materia vivente con aspetto omogeneo presente con caratteristiche simili in varie sedi del corpo Cellula TESSUTO Studio dei tessuti 4

5 POTERE DI RISOLUZIONE Occhio umano 200 nm (0.2 m) 100 m (0.1 mm) PR: 0.4 nm distanza minima alla quale due punti possono essere distinti come entità separate 10 nm 5

6 MICROSCOPIA OTTICA Consistenza INCLUSIONE Conservazione della struttura FISSAZIONE 6

7 MICROSCOPIA OTTICA 1- 2 ore per gradazione 1- 2 ore per recipiente Si fanno 2 – 3 cambi di xilolo per eliminare tutto lalcool Da pochi minuti ad 1-2 giorni Diafanizzazione Formella Qui viene versata la paraffina fusa La paraffina viene versata allinterno di formelle di plastica o rame di seguito, abbastanza velocemente, vengono allineati, i pezzi da includere 7

8 MICROSCOPIA OTTICA Inclusione Taglio Il taglio delle sezioni è effettuato utilizzando il microtomo 6-24 ore in totale Si fanno 2-3 cambi per eliminare tutto il solvente 8

9 MICROSCOPIA OTTICA Montaggio Colorazione e montaggio 2 per ogni recipiente20-30 per alcool Qui i vetrini possono rimanere per un certo tempo Ematossilina Eosina per X Montaggio 9

10 INCLUSIONE PER CONGELAMENTO TAGLIO Vantaggi Svantaggi Danneggiamento della morfologia dei tessuti Maggiore rapidità Migliore conservazione delle caratteristiche chimiche 10

11 MICROSCOPIA OTTICA FASI, OCCORRENTE, SCOPI E TEMPI NECESSARI PER L'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO ISTOLOGICO PRELIEVO di organi o tessuti da studiare forbici, pinzette, bisturi, lamette, piano di sughero o in materiale plastico loperazione va eseguita nel più breve tempo possibile FISSAZIONE Impedire la degenerazione dei tessuti per mantenere il più possibile inalterato il quadro strutturale dei tessuti Formalina neutra al 10% Il tempo di soggiorno dei pezzi nel fissativo varia da poche ore a 1-2 giorni INCLUSIONE Rendere il pezzo di consistenza tale da poter essere affettato allo spessore voluto (5-7 m) Serie di alcooli – Solvente del mezzo includente – Mezzo includente – Stufa a 56-60°C Da alcune ore a 1-2 giorni TAGLIO Affettare il pezzo in modo da poter essere osservato al microscopio Microtomo MONTAGGIO Disporre le sezioni su vetrini Vetrini portaoggetto - Piastratermostata COLORAZIONE Permettere losservazione della sezione al microscopio Coloranti MONTAGGIO Proteggere le sezioni e migliorare losservazione al micorscopio Vetrini coprioggetto - Montante 11

12 Ematossilina/Eosina Ematossilina Eosina Colorante basico che ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine) Colorante acido che ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol) Porzioni cellulari basofile Porzioni cellulari acidofile Alcuni esempi di colorazioni PAS (Acido Periodico Schiff) Dimostrazione della presenza di carboidrati. Tali strutture sono colorate in magenta Tricromica Utilizzata per evidenziare le fibre connettivali e per distinguerle da quelle muscolari Sudan black o osmio Per lipidi/mielina I lipidi non incorporano coloranti acquosi Impregnazione argentica o con oro Per processi cellulari e fibre delicate comprese quelle nervose Per lesame di strisci di sangue e di midollo osseo May-Grünwald-Giemsa Esiste una grande varietà di coloranti Questa tabella ne evidenzia alcuni dei più comuni 12

13 Come si osserva il campione? Attraverso un buon microscopio ottico Fotografandolo Interpretare il campione !!!! Sezione trasversale Sezione obliqua Sezione longitudinale 13

14 Allestimento di uno striscio COLORAZIONE 14

15 MICROSCOPI Microscopio ottico A contrasto di fase A contrasto di fase A interferenza A fluorescenza Confocale Permette di osservare cellule e tessuti a fresco Fornisce dati quantitativi E in grado di rivelare e localizzare molecole fluorescenti E in grado di mettere a fuoco piani diversi di un preparato 15

16 MICROSCOPIA ELETTRONICA Membrana cellulare RER Granuli di secrezione Mitocondri Nucleo Apparato di Golgi TEM SEM Entrambi basati sulluso di un fascio di elettroni TEM: Immagine derivata dallattraversamento delle strutture biologiche da parte degli elettroni permette lo studio della morfologia subcellulare SEM: basato sul principio di una immagine riflessa derivante dal rimbalzare degli elettroni sulla superficie del campione permette la visione tridimensionale della superficie di cellule e tessuti 16

17 Microscopio ottico e microscopio elettronico a confronto Sorgente luminosa: lampada Lente del condensatore Sezione istologica Obiettivo oculare Catodo: filamento Anodo Condensatore Preparato Obiettivo Proiettore Schermo fluorescente Quando usare il microscopio elettronico? La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio ottico P.R. Occhio: 0.2 mm = 200 m P.R. M. Ottico: 2000 Å = 200 nm P.R. TEM: 2Å 17

18 PREPARAZIONE DI CAMPIONI BIOLOGICI PER TEM. Fissazione 1. Fissazione Glutaraldeide tamponata a pH Postfissazione 2. Postfissazione Tetrossido di osmio Losmio agisce anche da colorante sia perché si lega come osmio ridotto alle lipoproteine e ad altri costituenti delle cellule sia perché losmio, a causa del suo elevato numero atomico, aumenta la diffrazione degli elettroni da parte dei costituenti cellulari, accentuandone il contrasto Disidratazione 3. Disidratazione Passaggi in soluzioni crescenti di etanolo Inclusione 4. Inclusione Resine epossidiche Taglio 5. Taglio Ultramicrotomo Lama di diamante o di vetro Sezioni che galleggiano in acqua Spessore da 40 a 100 nm. Montaggio 6. Montaggio Colorazione 7. Colorazione Visualizzazione 8. Visualizzazione Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini Retino Vetrino portaoggetto Blu di toluidina Microscopio ottico Coloranti elettronici TEM 18

19 Catodo: filamento Anodo Condensatore Preparato Obiettivo Proiettore Schermo fluorescenteTEMSEM Preparato Amplificatore elettronico SCHERMO Scanner Fascio di elettroni Elettroni secondari 19

20 MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE Vediamo di saperne un po di più… Minore potere di risoluzione rispetto al TEM Fornisce una immagine tridimensionale della superficie del campione Il campione non viene tagliato Usato per studiare la superficie cellulare Consente di valutare il rilievo degli oggetti 20

21 Come si prepara il campione per losservazione al SEM? Acquisizione del campione Il campione deve essere trattato con cura per non danneggiare la superficie Fissazione e Disidratazione No inclusione Il campione viene poggiato su un supporto Ricoperto con un metallo elettronconducente Visualizzato Fotografato Analizzato ai raggi X 21

22 Riassumendo …… MOTEMSEM Sorgente per lilluminazione lampadina Filamento elettronico ad alta tensione Lente condensatore Preparato Obiettivo 5 5. Oculare 6 6. Proiettore 7. Sistema di deflessione del fascio 8. Fotomoltiplicatore Schermo TV Lente di vetro Lente elettromagnetica Vetrino portasezione Retino portasezione Blocchetto metallizzato Lente di vetro Lente elettromagnetica *** OCCHIO SCHERMO FLUORESCENTE Immagine riflessa 22

23 Listologia moderna non si limita allosservazione descrittiva degli aspetti morfologici e strutturali di base di cellule e tessuti. Esistono numerose tecniche che consentono di rispondere a quesiti su aspetti funzionali della composizione di un tessuto Istologia funzionale Colture cellulari Istocitochimica Immunoistochimica Citometria a flusso Autoradiografia IBRIDAZIONE In Situ - Si prefigge di localizzare particolari molecole impiegando reazioni chimiche specifiche - Permette di dimostrare la presenza di specifiche sostanze nei tessuti utilizzando anticorpi - Permette di misurare alcuni parametri morfologici - Permette di approfondire le conoscenze della fisiologia cellulare - Permette studio e osservazione delle cellule viventi Biologia molecolare - NORTHERN BLOTTING - Permette di definire quali geni sono espressi da un tipo cellulare o tessuto - Permette di localizzare RNAm per specifiche proteine 23


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