Citometria a flusso La citometria a flusso è una metodica per l’analisi e caratterizzazione di particelle microniche, soprattutto di origine biologica.

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1 Citometria a flusso La citometria a flusso è una metodica per l’analisi e caratterizzazione di particelle microniche, soprattutto di origine biologica. Una sospensione di particelle (ad esempio cellule) viene convogliata da un sistema fluidico laminare di trasporto in un capillare fino al punto di misura.

2 Principio di funzionamento
Un fascio luminoso focalizzato intercetta il flusso di particelle e vengono generati segnali dall’incontro di ogni singola particella con la radiazione elettromagnetica. I segnali sono raccolti da un sistema di lenti, specchi dicroici e filtri ottici, e inviati ai rispettivi trasduttori che li convertono in segnali elettrici. Questi segnali elettrici vengono amplificati ed elaborati da un analizzatore che provvede alla rappresentazione grafica e all’analisi statistica.

3 Schema di un citometro a flusso
capillare fotomoltiplicatore software raggio Sorgente luminosa particella

4 Sistema fluidico Il sistema fluidico è di fondamentale importanza in quanto può influenzare il segnale letto dal rilevatore. Poiché il citofluorimetro rilevi una ad una le particelle presenti nel campione di partenza in maniera omogenea è necessario che lo strumento sia dotato di un sistema che immetta nel capillare ogni singola particella nello stesso punto.

5 Flusso laminare E’ necessario che nel capillare si instauri un flusso laminare (non turbolento). In condizioni di flusso laminare le forze di inerzia idrodinamica esercitate sulle particelle le mantengono durante il loro moto al centro del capillare (idrofocalizzazione del flusso).

6 Flusso laminare/2 flusso interno particella flusso esterno
In tali condizioni di flusso si possono considerare due regimi fluidici coassiali: quello interno (core flow) contiene le particelle, quello esterno (sheat flow) mantiene queste ultime lungo l’asse ideale di flusso. flusso interno particella flusso esterno

7 Flusso laminare/3 Agendo sul sistema pneumatico di trasporto che controlla la differenza di velocità tra il flusso interno e flusso esterno si regola la velocità di flusso delle particelle all’interno del capillare per ottenere segnali per singole particelle.

8 Tipi di segnale I segnali originati sono solitamente di tre tipi:
Diffusione a basso angolo (Forward scatter) Diffusione a 90° (Side scatter) Fluorescenza Tali segnali sono quindi legati alle caratteristiche fisiche della particella e alla eventuale presenza di molecole fluorescenti localizzate in esse.

9 (intensità dipendente dalle dimensioni della particella)
Forward Scatter fotomoltiplicatore raggio particella raggi diffratti (intensità dipendente dalle dimensioni della particella)

10 Forward Scatter/2 Il segnale di Forward Scatter non dipende solo dalle dimensioni delle cellule, ma anche dalla posizione del capillare nel il laser colpirà la particella A Particelle delle medesime dimensioni che generano due segnali di Forward Scatter differenti B A B

11 Side Scatter Il Side Scatter è in relazione con le caratteristiche superficiali della particella in quanto il segnale è in relazione alla riflessione della luce incidente da parte della superficie della particella. FS SS

12 Sorgenti luminose La citometria a flusso è in larga parte utilizzata per la caratterizzazione di cellule intere. In questi casi la sorgente utilizzata è laser ad Argon, di potenza tra i 15 mW e 5 W, centrata su una lunghezza d’onda di 488 nm (blu). La sorgente al laser Ar possiede una elevata intensità, permette la focalizzazione della radiazione su di una sezione molto ridotta (dimensioni cellulari) e l’ eccitazione di numerosi fluorofori.

13 Sorgenti al laser La sorgente ad Ar ha un costo relativamente elevato e permette l’emissione ad un ridotto numero di lunghezze d’onda: 514, 488 e 345 nm. Altri tipi di sorgenti laser a  differenti sono impiegate in citometria a flusso: Kripton Elio Neon

14 Altre sorgenti Una sorgente di radiazione più economica e policromatica è la lampada a vapori di mercurio. Tale sorgente ha questi svantaggi per l’impiego in citometria a flusso: radiazione poco potente scarsa stabilità nella luce di emissione sistemi elettronici di compensazione rapido decadimento

15 Citometria a flusso di cellule
Segnali legati alle caratteristiche cellulari: SS FS Volume (diametro) o dimensioni Rapporto nucleo/citoplasma Granulosità interna Rugosità di membrana Fluorescenza Presenza di marcatori di superficie Indicatori di attività enzimatica intracellulare Indicatori di vitalità

16 Cella del citometro a flusso
Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid Coulter Cytometry

17 Forward Angle Light Scatter
FALS Sensor Laser Coulter Cytometry

18 90 Degree Light Scatter Laser FALS Sensor 90LS Sensor
Coulter Cytometry

19 Fluorescence detector
Fluorescence Detectors Fluorescence FALS Sensor Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.) Laser Coulter Cytometry

20 Tipi di immunofluorescenza per FC
La fluorescenza è ottenuta mediante il legame di uno o più anticorpi marcati con un fluorocromo ad uno o più antigeni di membrana. Queste tecniche vengono definite “tecniche di immunofluorescenza diretta e indiretta” DIRETTA INDIRETTA singola doppia tripla

21 Immunofluorescenza singola diretta
Anticorpo I (a) Antigene “a” Fluorocromo 1

22 Immunofluorescenza singola indiretta
Anticorpo I (a) Anticorpo II (a) Antigene “a” Fluorocromo 1

23 Immunofluorescenza doppia diretta
Anticorpo I (b) Anticorpo I (a) Antigene “a” Antigene “b” Fluorocromo 1 Fluorocromo 2

24 Immunofluorescenza doppia indiretta
Anticorpo I (b) Anticorpo I (a) Antigene “a” Antigene “b” Anticorpo II (b) Anticorpo II (a) Fluorocromo 1 Fluorocromo 2

25 Immunofluorescenza tripla diretta
Anticorpo I (b) Anticorpo I (a) Antigene “a” Antigene “b” Fluorocromo 1 Fluorocromo 2 Fluorocromo 3 Antigene “c” Anticorpo I (c)

26 Immunofluorescenza tripla indiretta
Anticorpo I (b) Anticorpo I (a) Antigene “a” Antigene “b” Fluorocromo 2 Fluorocromo 3 Antigene “c” Anticorpo I (c) Anticorpo II (b) Anticorpo II (a) Fluorocromo 1

27 Ottica a tripla fluorescenza
PMT 4 Filtri dicroici PMT 3 Cella a flusso PMT 2 Filtri a banda passante PMT 1 Laser Coulter Cytometry

28 Analisi dei dati Dalla combinazione dei due tipi di segnali si ottiene un particolare diagramma bidimensionale detto “citogramma a dot–plot” In un citogramma ogni punto rappresenta un evento contato, dotato di un definito valore correlato ai parametri misurati. I citogrammi mettono in relazione correlazione 2 differenti parametri rilevati, solitamente 2 tipi di fluorescenza oppure una fluorescenza ed uno scattering (FS o SS)

29 Citogramma FS/SS: studio morfologico
Coulter Cytometry

30 FS/SS di cellule del sangue
FSC SSC linfociti granulociti monociti eritrociti

31 Linfociti umani sani Mean diameter: 8 mm Morphology:
dense large nucleus thin cytoplasm T-lymphocytes % smooth cells B-lymphocytes 5-10% villous cells T-lymphocytes B-lymphocytes Lymphocyte are the white blood cell of immune system. They activate the immune response. There are two major types: T (about 90%)defense cell use in cell-mediated immunity and they develop in thymus; B (about 10%)cell which nature in bone marrow and are responsible for producing antibodies. There are also some lymphocytes not designed as T or B with specialized ability to kill tumors and infected cells) Each Lymphocytes have specific receptor protein on their membrane , from here the specificty of immune system. Lymphocytes have large, dense round nucleus and thin cytoplasm. From SEM pictures: B lymphocytes are villous cells, thay have complex surface architetture with multiple microvillicovering almost the entire surface varying in lenght up to 900 nm (occasionaly up to 1.7 um) and in bradth from 70 to 230 nm(some up to 350 nm) T lymphocytes relatively smooth cell with small stub-like projections or relatively large number of microvilli.     Lymphocytes were isolated using Ficoll-Paque density gradients. Blood was diluted 1:1 with phosphate buffered saline, and layered onto Ficoll-Paque with ratio of blood+PBS : Ficoll maintained 4:3. The blood was centrifugated at 1800 rpm for 35 min at room temperature. The lymphocyte layer (buffy coat) was removed and washed twice in PBS at 1200 rpm for 10 min each, following the same wash with media RPMI Cell density was counted with a hemocytometer. CD45+/CD19+ CD45+/CD19-

32 Linfociti umani neoplastici
Raji lymphocytes Burkitt’s lymphoma cell line 2 mm Morphology: larger B-lymphocytes, lower nucleus density Mean diameter: 14 mm CD45+/CD19+ EBV infection of B-lymphocytes in vitro effiiently induces cell immortalization into permanent cell line. EBV immortalized B cells are described as lymphoblastoid in appearance. (99). Relative to the quiescent precursor B lymphocyte, the immortalized cells have an enlarged appearance due to the increased cytoplasmic volume required to support high rates of RNA and protein synthesis. They are typically ovoid or slightly elongated and frequently have a cluster of short villipodia projecting from the surface. So generally EBV infectio cause cell aggregation, increased cell size and suden increase in growth. During serial in vitro culturing, the EBV-carrying, but not the EBV-negative, BL lines tend to drift toward a more lymphoblastoid (LCL-like) phenotype, characterized by the expression of adhesion molecules and other immunoblastic activation markers. Healthy B-lymphocytes Mean diameter: 8 mm Morphology: dense large nucleus thin cytoplasm 2 mm

33 CD45/FS e CD45/SS di linfociti sani e neoplastici
Healthy lymphocytes Raji cells B (19+) CD45 SS T (19-) B (19+) Other leukocytes CD45 FS T (19-) + B (19+)

34 Citogramma CD45/CD19 Rappresentazione bidimensionale della doppia fluorescenza di una popolazione di linfociti B+T sani e linfociti B neoplastici 5 % 95% healthy B cells T cells

35 Citogramma CD45/FS e CD45/SS
Neoplastic B cells Healthy T and B cells Rappresentazione bidimensionale di fluorescenza singola e scattering di una popolazione di linfociti B+T sani e linfociti B neoplastici CD45 SS Healthy T and B cells neoplastic B cells

36 Citometro a flusso come cell sorter
Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid Flow Cell In the cytometry the cells are in suspension flowing inside the sheath fluid When the cells pass the light source they scatter light and emit fluorescence that is collected and detected. Light source is usually argon laser. Light Source: Argon laser is the most popular light source (wavelength 488 nm).

37 Fluorescence detector
Citometro a flusso come selettore cellulare 488 nm laser FS Sensor Fluorescence detector - + Charged Plates And then about the cell sorting. In cell sorting, we can chose what are the properties of the cells what we what to sort. Here we can charge the drop based on these properties and then the drop can be separated using charged plates. In one drop there are one cell so single cells can be sorted. Single cells sorted into test tubes

38 Citofluorimetro analizzatore
Coulter Cytometry

39 Citofluorimetro selezionatore cellulare
Coulter Cytometry

40 Morfologia - Gate Coulter Cytometry

41 Morfologia - Gate Coulter Cytometry

42 Schema di un citofluorimetro
laser (2W) 488 nm 525 nm specchio dicroico specchio normale filtro bloccante filtro “band pass” visto in sezione!! 10 mW 0,02 mW 2 mW Specchio dicroico  fa passare solo una lunghezza d’onda mentre le altre vengono riflesse Filtro bloccante  blocca a 488 nm Filtro band pass  fa passare dolo i 525 nm

43 I segnali inviati dai sensori, proporzionali in maniera continua alle dimensioni del parametro misurato, vengono trasformati dai fotomoltiplicatori in impulsi elettrici veri e propri che vengono poi interpretati da software opportuni in valori numerici (utilizzati poi per costituire i plot di analisi).

44 I segnali inviati dai sensori (proporzionali alle caratteristiche fisiche delle cellule) vengono trasformati dai fotomoltiplicatori e fotodiodi (interfaccia dello strumento) in segnali elettrici. Questi ultimi devono, a loro volta, essere amplificati in modo da avere massimi di picco evidenziabili in forma lineare o logaritmica.

45 “Forward Scatter” FSC Numero di eventi FSC Numero di eventi

46 Citofluorimetro – Rappresentazione grafica

47 La rappresentazione più semplice di un dato citometrico è un istogramma in cui gli eventi osservati danno un diagramma di distribuzione.

48 Sull’asse delle ordinate è riportato il numero di eventi.
Sull’asse delle ascisse è riportata una delle caratteristiche misurate dal citometro, solitamente il “Forward Scatter” (dimensione delle cellule) o la fluorescenza. Sull’asse delle ordinate è riportato il numero di eventi.

49 Esempio di istogramma B B A A A Numero di eventi B FSC

50 Un istogramma può essere rappresentato in scala lineare o logaritmica.

51 Scala lineare Si utilizza una rappresentazione lineare quando la variazione del segnale è entro limiti ristretti. Solitamente vengono utilizzati istogrammi lineari per la misura del contenuto di DNA in una popolazione cellulare (quando il rapporto tra i picchi è intorno al fattore 2).

52 Scala lineare Es: analisi DNA di una popolazione di cellule normali rappresentata su scala lineare

53 Scala logaritmica Si utilizza una rappresentazione logaritmica quando la variazione del segnale, determinato dalla non omogeneità della popolazione, è ampia. Solitamente vengono utilizzati istogrammi logaritmici per la misura della fluorescenza (soprattutto quando le differenze tra controllo positivo e negativo sono > 102 – 103).

54 Scala logaritmica Es: analisi di una popolazione di linfociti marcati con anti–CD4 fluoresceinato

55 Immunofluorescenza per analisi del ciclo cellulare
Questo tipo di analisi è utile per evidenziare le differenti fasi del ciclo cellulare in cui si possono trovare le cellule di una determinata popolazione.

56 Per marcare il DNA si utilizza lo ioduro di propidio, colorante intercalante del DNA che viene eccitato a 488 nm ed emette nello spettro del rosso (625 nm). Lo ioduro di propidio è in grado di penetrare esclusivamente nelle cellule permeabilizzate o morte. preparare la soluzione permeabilizzante le cellule (Triton X–100) contenente PI unire la soluzione di PI alla linea cellulare preparare la linea cellulare

57 cellula permeabilizzata
citosol nucleo membrana + PI cellula permeabilizzata cellula marcata cellula

58 Compensazione La compensazione è importantissima per impedire che l’emissione di un fluorocromo possa essere rilevata anche da un fotomoltiplicatore destinato al rilevamento di una differente lunghezza d’onda (ovvero per la rilevazione dell’emissione da parte di un fluorocromo diverso).

59 Esempio di compensazione
Duo–CHROME FITC Intensità relativa 500 600 700 Lunghezza d’onda (nm)

60 Nell’esempio precedente si nota che il FITC emette in un range di lunghezze d’onda () in parte rilevate anche dal canale per la lettura del fluorocromo PE. La stessa cosa succede per il Duo–CHROME, che emette sia vicino al canale per il FITC sia in corrispondenza del canale per il PE.

61 La compensazione si ottiene sottraendo elettronicamente il segnale proveniente del fluorocromo che interferisce al segnale rilevato dal fotomoltiplicatore per la lettura del fluorocromo di interesse. Ciò è importantissimo per identificare le migliori condizioni di lavoro per le quali la lettura di cellule legate ad un anticorpo marcato con uno specifico fluorocromo non vengano rilevate dal fotomoltiplicatore per un altro tipo di fluorocromo.

62 COMPENSAZIONE ASSENTE
Rappresentazione di una popolazione di linfociti con compensazioni diverse COMPENSAZIONE ASSENTE

63 COMPENSAZIONE CORRETTA
Rappresentazione di una popolazione di linfociti con compensazioni diverse COMPENSAZIONE CORRETTA

64 COMPENSAZIONE ECCESSIVA
Rappresentazione di una popolazione di linfociti con compensazioni diverse COMPENSAZIONE ECCESSIVA

65 Fotodiodi e fotomoltiplicatori
Una volta che la radiazione è stata deviata dalla particella (a seconda del parametro preso in considerazione) questa collide contro i detector. Tali detector sono solitamente costituiti da fotodiodi, ovvero materiale in grado, una volta stimolati da una radiazione, di generare una piccola corrente elettrica.

66 Nel caso di una doppia fluorescenza indiretta bisogna specificare il tipo di immunoglobuline utilizzate come anticorpo primario e come secondario. Solitamente gli anticorpi primari sono entrambi IgG monoclonali (mAb) di topo (mouse), ma differenti nella sottoclasse: per l’antigene “a” si può utilizzare una IgG1 mentre per l’antigene “b” una IgG2A.

67 Gli anticorpi secondari, invece, sono di solito policlonali (goat anti–mouse o GAM). Questi anticorpi riconoscono i diversi isotipi delle Ig legate alla cellula. Nel caso illustrato precedentemente l’anticorpo II anti–Ab I “a” (GAM–FITC) riconosce come isotipo IgG1, mentre l’anticorpo II anti–Ab I “b” (GAM–PE) riconosce come isotipo IgG2A. Ciò è importantissimo per far si che non si creino legami aspecifici tra le varie Ig presenti.

68 Rappresentazione grafica dei segnali rilevati
Istogramma Bidimensionale (“Dot–Plot”)

69 “Gate” La selezione elettronica delle cellule da esaminare (ovvero il “gate”) è una caratteristica molto importante dei citometri a flusso. Esso permette di isolare una particolare sottopopolazione cellulare in base a determinati parametri, per poi valutarne importanti caratteristiche che rimarrebbero “mascherate” dalla presenza delle restanti popolazioni.

70 “Dot–Plot” con “Gate” Es: rappresentazione bidimensionale di una popolazione di sangue periferico dopo lisi dei globuli rossi

71 Il “Dot–Plot” è utilizzato soprattutto per rappresentare i segnali di fluorescenza.

72 CITOMETRIA DI FLUSSO Coulter Cytometry

73 Cos’e`? LA CITOMETRIA DI FLUSSO E’ LA MISURAZIONE
DELLE PROPRIETA’ CELLULARI, SIA STRUTTURALI SIA FISICHE O FISIOLOGICHE DI OGNI SINGOLA CELLULA. Coulter Cytometry

74 Citometro di Flusso E’ UNO STRUMENTO CHE CI PERMETTE DI ANALIZZARE
INDIVIDUALMENTE LE CELLULE, FACENDOLE PASSARE DAVANTI AD UNA CAMERA DI RILEVATORI, CON UNA ELEVATA VELOCITA DI ANALISI. Coulter Cytometry

75 Citometro di Flusso - Funzionamento
Funziona con misurazione esclusiva della luce. Utilizza sospensioni di particelle o cellule da analizzare. Illuminazione con Laser (la maggioranza in commercio) Sistema Multiparametrico con 2 misurazioni della dispersione della luce laser e fino a 8 fluorescenze simultaneamente per ogni particella. Dati classificati in parametri con una risoluzione di 1024 canali e rappresentati sotto forma di istogrammi o citogrammi. Valutazione statistica dei dati (percentuale, canale medio di accumulo, conta, deviazione standard, coefficiente di variazione ecc.) Coulter Cytometry

76 Citometro di Flusso - Sorgenti di Illuminazione
LAMPADE A MERCURIO Emettono un ampio rango di lunghezze d’onda (da UV fino 600 nm) Difficile da focalizzare in aree molto piccole con grande perdita di intensità. LASER Luce coerente, monocromatica (produce meno autofluorescenza) non dispersa ,la quale può essere focalizzata in aree piccole (nel ordine dei micron) senza perdere praticamente intensità Coulter Cytometry

77 Citometro de Flusso - Tipi di Laser
Gas di Argon con emissione a 488 nm e’ il più usato perché eccita la maggior parte dei fluorocromi adoperati in citometria. Gas Argon Sintonizzabile da 350 a 529 nm. si usa per la sua emissione UV ad alta stabilitá e la emissione a 488 nm. Miscela di gas helio-neon con emissione a 633 nm. con emissione a 544 nm. Miscela di gas argon-kripton. emissioni sintonizzabili da UV fino 630 nm. Dissoluzione di Rodamina (dye laser) eccitata con un laser ad argon, emette radiazione laser continua da 580 a 650 nm circa. La selezione delle lunghezze d’onda si fa a traverso un collimatore. Coulter Cytometry

78 Citometro di Flusso - Rilevatori
FOTODIODI Utilizzati per rilevare la dispersione di luce incidente frontale (FS) e laterale (SS). La quantità di luce incidente si regola tramite filtri ottici. Questi impulsi dopo vengono amplificati ottenendo in uscita impulsi di fino a 10 volts di ampiezza. FOTOMOLTIPLICATORI (PMT) Utilizzati per la rilevazione della fluorescenza , che sono dei segnali più deboli rispetto ai FS e SS. I segnali vengono amplificati a traverso la sensibilità del PMT (voltaggio applicato al rilevatore che va da 0 fino 2000 V), ottenendo in uscita impulsi di fino a 10 volts di ampiezza. Coulter Cytometry

79 Citometro di Flusso - Tipi di Segnali
I fotomoltiplicatori generano tre tipi basici di segnali: PICCO: e il segnale primario, della durata uguale al tempo che impiega la cellula ad attraversare il laser (de 2 a 10µs) e la massima altezza indica la massima emissione di luce che accade quando la particella si trova in mezzo alla zona di illuminazione. INTEGRALE: segnale derivata dalla prima, la cui massima altezza si raggiunge quando la particella ha attraversato totalmente la zona di illuminazione (da 2 a 10 µs). Si utilizza questo segnale per popolazioni abbastanza omogenee. LOGARITMICO: signale derivata del integrale, utilizzata per quantificare popolazioni molto eterogenee. Coulter Cytometry

80 Camera di Flusso - Beam Shaper
Coulter Cytometry

81 Fluorescence detector
Fluorescence Activated Cell Sorting 488 nm laser FALS Sensor Fluorescence detector - + Charged Plates Single cells sorted into test tubes Coulter Cytometry

82 Fluorescein (FITC) Protein Excitation Emisson
300 nm nm nm nm nm Wavelength 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Protein Coulter Cytometry

83 Propidium Iodide DNA Excitation Emisson
300 nm nm nm nm nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm DNA PI Coulter Cytometry

84 Phycoerytherin (PE) Protein Excitation Emisson
300 nm nm nm nm nm Protein Coulter Cytometry

85 Allophycocyanin (APC)
Protein 632.5 nm (HeNe) 300 nm nm nm nm nm Excitation Emisson Coulter Cytometry

86 PE-TR Conj. Texas Red PI Ethidium PE FITC cis-Parinaric acid Common
Laser Lines 600 nm 300 nm 500 nm 700 nm 400 nm 457 350 514 610 632 488 PE-TR Conj. Texas Red PI Ethidium PE FITC cis-Parinaric acid Coulter Cytometry

87 Sistema Ottico a 3 Colori
Coulter Cytometry

88 Flow Cytometry Optics Laser Dichroic Filters Flow cell Bandpass
PMT 4 Dichroic PMT Filters 3 Flow cell PMT 2 Bandpass Filters PMT 1 Laser Coulter Cytometry

89 Optical Filters Dichroic Filter/Mirror at 45 deg Light Source
Transmitted Light Reflected light Coulter Cytometry

90 Standard Band Pass Filters
630 nm BandPass Filter White Light Source Transmitted Light nm Light Coulter Cytometry

91 Standard Long Pass Filters
520 nm Long Pass Filter Light Source Transmitted Light >520 nm Light Standard Short Pass Filters 575 nm Short Pass Filter Light Source Transmitted Light <575 nm Light Coulter Cytometry