La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

ANALISI AUTOMATICA DI MARCATORI GENETICI POLIMORFICI DEL DNA (STR,SNP) E SUE APPLICAZIONI IN CAMPO BIOMEDICO Laboratorio di Oncoematologia Pediatrica (BO)

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "ANALISI AUTOMATICA DI MARCATORI GENETICI POLIMORFICI DEL DNA (STR,SNP) E SUE APPLICAZIONI IN CAMPO BIOMEDICO Laboratorio di Oncoematologia Pediatrica (BO)"— Transcript della presentazione:

1 ANALISI AUTOMATICA DI MARCATORI GENETICI POLIMORFICI DEL DNA (STR,SNP) E SUE APPLICAZIONI IN CAMPO BIOMEDICO Laboratorio di Oncoematologia Pediatrica (BO) Dott.ssa Virginia Libri

2 MARCATORE GENETICO Qualsiasi carattere polimorfico mendeliano che può essere impiegato per seguire lereditarietà di un segmento cromosomico attraverso un albero genealogico Qualsiasi carattere polimorfico mendeliano che può essere impiegato per seguire lereditarietà di un segmento cromosomico attraverso un albero genealogico

3 POLIMORFISMO I polimorfismi genetici sono variazioni nelle sequenze di DNA presenti in una popolazione con una frequenza maggiore dell1%. Quando la frequenza e' inferiore a tale valore arbitrario, si preferisce parlare di varianti genetiche rare, che in molti loci sono presenti in aggiunta ai polimorfismi. I polimorfismi genetici sono variazioni nelle sequenze di DNA presenti in una popolazione con una frequenza maggiore dell1%. Quando la frequenza e' inferiore a tale valore arbitrario, si preferisce parlare di varianti genetiche rare, che in molti loci sono presenti in aggiunta ai polimorfismi.

4 RFLP La regione del genoma di interesse viene amplificata tramite PCR e i prodotti ottenuti vengono incubati con un enzima di restrizione in grado di riconoscere una sequenza specifica e di catalizzare una reazione di taglio al suo interno La regione del genoma di interesse viene amplificata tramite PCR e i prodotti ottenuti vengono incubati con un enzima di restrizione in grado di riconoscere una sequenza specifica e di catalizzare una reazione di taglio al suo interno I primi marcatori molecolari ad essere studiati furono gli RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism):particolari tratti di DNA presenti nella popolazione e trasmessi in modo ereditario I primi marcatori molecolari ad essere studiati furono gli RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism):particolari tratti di DNA presenti nella popolazione e trasmessi in modo ereditario

5 RFLP: Gel di Elettroforesi Mediante elettroforesi su gel di agarosio si è in grado di determinare se il frammento amplificato è stato tagliato o meno, cioè se la sequenza specifica riconosciuta dallenzima è presente inalterata oppure no Mediante elettroforesi su gel di agarosio si è in grado di determinare se il frammento amplificato è stato tagliato o meno, cioè se la sequenza specifica riconosciuta dallenzima è presente inalterata oppure no Direzione di Migratione I frammenti più grandi migrano più lentamente rispetto a quelli più corti

6 RFLP I frammenti possono avere lunghezza diversa nei diversi individui ma anche tra i due cromosomi di uno stesso individuo, ciò è possibile se tra due siti di restrizione è presente una sequenza che può variare in lunghezza (VNTR)o se esiste una variante polimorfa che introduce o elimina un altro sito di restrizione per lo stesso enzima modificando la grandezza dei frammenti ottenuti per digestione. I frammenti possono avere lunghezza diversa nei diversi individui ma anche tra i due cromosomi di uno stesso individuo, ciò è possibile se tra due siti di restrizione è presente una sequenza che può variare in lunghezza (VNTR)o se esiste una variante polimorfa che introduce o elimina un altro sito di restrizione per lo stesso enzima modificando la grandezza dei frammenti ottenuti per digestione.

7 Considerazioni sulla metodica Uno svantaggio di questo tipo di marcatori è dato dalla loro bassa informatività Uno svantaggio di questo tipo di marcatori è dato dalla loro bassa informatività Infatti gli RFLP presentano solo due alleli possibili: il sito di restrizione può essere intatto oppure no Infatti gli RFLP presentano solo due alleli possibili: il sito di restrizione può essere intatto oppure no Limpiego di questi marcatori per eseguire la mappa genetica di patologie è poco attuabile in quanto troppo spesso delle meiosi chiave in una famiglia risultano non informative Limpiego di questi marcatori per eseguire la mappa genetica di patologie è poco attuabile in quanto troppo spesso delle meiosi chiave in una famiglia risultano non informative Occorre un pedigree completo con entrambi genitori e un precedente figlio Occorre un pedigree completo con entrambi genitori e un precedente figlio Occorre trovare un enzima di restrizione che nel genitore affetto frammenti il DNA in modo tale da creare una situazione di eterozigosi Occorre trovare un enzima di restrizione che nel genitore affetto frammenti il DNA in modo tale da creare una situazione di eterozigosi

8 The human genome 100 % 30% Intersperdrepetitive SINEs (<500bp) LINEs (>500bp) Gene/gene related sequences Extragenic DNA Coding regions 70% 70% Introns,promoter, Pseudogenes,gene fragments 3% 27% Unique 55% 55% Repetitive 15% Tandemlyrepeated Satellite Microsatellite Minisatellite Telomeric Hypervariable Sequenzial breakdown of the genome into component DNA types (Bennett P: Demystified...Microsatellites. J Clin Pathol:Mol Pathol 2000,53: )

9 DNA ripetitivo intersperso Le singole unità ripetute non sono raggruppate ma sparse in più punti del genoma. Gli esempi più comuni sono le sequenze SINEs (Short Interspersed Nuclear Element) e LINEs (Long Interspersed Nuclear Element) Le singole unità ripetute non sono raggruppate ma sparse in più punti del genoma. Gli esempi più comuni sono le sequenze SINEs (Short Interspersed Nuclear Element) e LINEs (Long Interspersed Nuclear Element)LINEs Sono associate prevalentemente a DNA genomico ricco in A/T perché tendono a posizionarsi in regioni del cromosoma povere di geni allo scopo di imporre il minimo impatto mutazionale al genoma. Sono associate prevalentemente a DNA genomico ricco in A/T perché tendono a posizionarsi in regioni del cromosoma povere di geni allo scopo di imporre il minimo impatto mutazionale al genoma.SINEs Sono associate prevalentemente a DNA genomico ricco in G/C. Sembra che tali sequenze svolgano una qualche funzione positiva per il genoma: esse sarebbero espresse in condizioni di stress ed i risultanti RNA legherebbero una particolare protein chinasi PKR e bloccherebbero la sua capacità di inattivare la traduzione. Sono associate prevalentemente a DNA genomico ricco in G/C. Perché? Sembra che tali sequenze svolgano una qualche funzione positiva per il genoma: esse sarebbero espresse in condizioni di stress ed i risultanti RNA legherebbero una particolare protein chinasi PKR e bloccherebbero la sua capacità di inattivare la traduzione.

10 DNA ripetuto in tandem DNA costituto da blocchi di sequenze che possono trovarsi in poche o in molte localizzazioni cromosomiche differenti. A seconda delle dimensioni medie del blocco di unità ripetute è possibile suddividere questo DNA non codificante in subclassi: satellite,minisatellite e microsatellite. DNA costituto da blocchi di sequenze che possono trovarsi in poche o in molte localizzazioni cromosomiche differenti. A seconda delle dimensioni medie del blocco di unità ripetute è possibile suddividere questo DNA non codificante in subclassi: satellite,minisatellite e microsatellite. DNA satellite comprende un grande gruppo di blocchi di DNA ripetuto in tandem con singole unità ripetute più o meno complesse. Il DNA di questo tipo non è trascritto e praticamente costituisce il grosso delleterocromatina del genoma localizzata al centromero (eterocromatina pericentrica) DNA satellite comprende un grande gruppo di blocchi di DNA ripetuto in tandem con singole unità ripetute più o meno complesse. Il DNA di questo tipo non è trascritto e praticamente costituisce il grosso delleterocromatina del genoma localizzata al centromero (eterocromatina pericentrica) DNA satellite DNA minisatellite comprende due tipi di sequenze di DNA ripetuto in tandem, non trascritto, di modeste dimensioni e disperso nel genoma nucleare: minisatelliti telomerici e minisatelliti ipervariabili DNA minisatellite comprende due tipi di sequenze di DNA ripetuto in tandem, non trascritto, di modeste dimensioni e disperso nel genoma nucleare: minisatelliti telomerici e minisatelliti ipervariabili

11 DNA TELOMERICO Questo tipo di DNA è localizzato allestremità dei cromosomi, nei telomeri Questo tipo di DNA è localizzato allestremità dei cromosomi, nei telomeri Il costituente principale del DNA telomerico è rappresentato da 10-15kb di unità esanucleotidiche ripetute in tandem, in particolare TTAGGG, che vengono aggiunte da un enzima specializzato, la telomerasi Il costituente principale del DNA telomerico è rappresentato da 10-15kb di unità esanucleotidiche ripetute in tandem, in particolare TTAGGG, che vengono aggiunte da un enzima specializzato, la telomerasi Tali ripetizioni sono responsabili della funzione dei telomeri in quanto agiscono come protezioni delle estremità dei cromosomi dalla degradazione e dalle perdite di materiale Tali ripetizioni sono responsabili della funzione dei telomeri in quanto agiscono come protezioni delle estremità dei cromosomi dalla degradazione e dalle perdite di materiale Inoltre forniscono un meccanismo per la replicazione delle estremità lineari del DNA cromosomico Inoltre forniscono un meccanismo per la replicazione delle estremità lineari del DNA cromosomico

12 DNA minisatellite ipervariabile o VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) Sono sequenze altamente polimorfiche ed organizzate in oltre 1000 gruppi (lunghi da 0.1 a 20 kb) di corte unità ripetute in tandem, che variano considerevolmente per dimensioni ma posseggono una sequenza comune centrale (core),GGGCAGGAG Sono sequenze altamente polimorfiche ed organizzate in oltre 1000 gruppi (lunghi da 0.1 a 20 kb) di corte unità ripetute in tandem, che variano considerevolmente per dimensioni ma posseggono una sequenza comune centrale (core),GGGCAGGAXG Molti di questi gruppi si trovano vicino ai telomeri Molti di questi gruppi si trovano vicino ai telomeri La maggior parte di queste sequenze non sono trascritte eccetto alcuni elementi allinterno di sequenze intrageniche non codificanti La maggior parte di queste sequenze non sono trascritte eccetto alcuni elementi allinterno di sequenze intrageniche non codificanti Il significato non è ancora chiaro, ma indipendentemente dalla loro reale funzione nel genoma umano, esiste un utilizzo pratico di questi gruppi, ma in genere delle sequenze ripetute, nel DNA fingerprinting (impronta digitale del DNA) Il significato non è ancora chiaro, ma indipendentemente dalla loro reale funzione nel genoma umano, esiste un utilizzo pratico di questi gruppi, ma in genere delle sequenze ripetute, nel DNA fingerprinting (impronta digitale del DNA)

13 DNA fingerprinting La molecola del DNA possiede caratteristiche che consentono di differenziare i diversi individui perché,diversamente da un impronta digitale convenzionale,limpronta digitale del DNA non può essere alterata da alcun trattamento conosciuto La molecola del DNA possiede caratteristiche che consentono di differenziare i diversi individui perché,diversamente da un impronta digitale convenzionale,limpronta digitale del DNA non può essere alterata da alcun trattamento conosciuto Queste differenze vengono utilizzate per studi che trovano sviluppo in diversi ambiti: Queste differenze vengono utilizzate per studi che trovano sviluppo in diversi ambiti: Forense: risoluzione dei crimini Forense: risoluzione dei crimini identificazione vittime identificazione vittime Medico: diagnosi dei disordini ereditati Medico: diagnosi dei disordini ereditati cure di sviluppo per i disordini ereditati cure di sviluppo per i disordini ereditati test di paternità test di paternità Evoluzionistico:comportamento degli animali popolazioni genetiche popolazioni genetiche

14 Minisatelliti: Riconosciuti su gel dopo amplificazione con PCR

15 DNA minisatellite ipervariabile PROBLEMI I VNTR presentano delle difficoltà relative alla genotipizzazione in quanto vista la loro lunghezza tali marcatori vengono amplificati con difficoltà in una reazione di PCR I VNTR presentano delle difficoltà relative alla genotipizzazione in quanto vista la loro lunghezza tali marcatori vengono amplificati con difficoltà in una reazione di PCR Non sono uniformemente distribuiti in tutto il genoma Non sono uniformemente distribuiti in tutto il genoma

16 ALTRA CATEGORIA DI MARCATORI MOLECOLARI

17 DNA Microsatellite o STR (Short Tandem Repeat) Le famiglie di DNA microsatellite includono piccoli blocchi di ripetizioni in tandem,da volte,semplici nella sequenza (1-6bp)e dispersi nel genoma Sono numerosi, con una densità media stimata intorno ad 1 STR ogni 30,000-10,000bp Il numero di ripetizioni varia frequentemente tra gli alleli portando ad un alto grado di polimorfismo Sono abbastanza comuni le ripetizioni mononucleotidiche (A)n o (T)n che arrivano a costituire in tutto ca 10 Mb,ovvero lo 0.3% del genoma nucleare Le ripetizioni di (G)n e di(C)n sono, al contrario,più rare

18 DNA Microsatellite o STR Le ripetizioni dinucleotidiche CA/TG (TG sul filamento complementare)sono molto comuni; costituiscono infatti ca lo 0.5% del genoma Sono altamente polimorfiche Sono diffuse anche le ripetizioni CT/AG che si verificano in media ogni 50 kb e costituiscono ca lo 0.2% del genoma Le ripetizioni CG/GC risultano molto rare, questo perché i residui C affiancati in 3da un residuo G (cioè CpG)sono soggetti a metilazione e a successiva deaminazione, diventando TpG (o CpA sullaltro filamento)

19 DNA Microsatellite o STR Le ripetizioni in tandem di tre nucleotidi nel DNA codificante possono essere siti soggetti ad espansione patologica. Esempio: Caso del sito fragile dellX (causata da una mutazione nel gene FMR1, che codifica per una proteina implicata nello sviluppo delle sinapsi) Caso del sito fragile dellX (causata da una mutazione nel gene FMR1, che codifica per una proteina implicata nello sviluppo delle sinapsi) Corea di Huntington (patologia ereditaria causata dalla degenerazione di neuroni localizzati in specifiche aree del cervello) Corea di Huntington (patologia ereditaria causata dalla degenerazione di neuroni localizzati in specifiche aree del cervello) Distrofia miotonica (chr 19, CTG è ripetuta da 50 fino a migliaia di volte nei soggetti patologici) e certi tipi di atassia cerebellare Distrofia miotonica (chr 19, CTG è ripetuta da 50 fino a migliaia di volte nei soggetti patologici) e certi tipi di atassia cerebellare (Bennett P: Demystified... Microsatellites. J Clin Pathol:Mol Pathol 2000,53: ) I trinucleotidi e i tetranucleotidi ripetuti in tandem sono relativamente rari ma spesso polimorfici e potenzialmente utili per lidentificazione di marcatori altamente polimorfici I trinucleotidi e i tetranucleotidi ripetuti in tandem sono relativamente rari ma spesso polimorfici e potenzialmente utili per lidentificazione di marcatori altamente polimorfici I microsatelliti sono evidenziabili non solo nel DNA intergenico o dentro gli introni ma esempi ne sono stati riportati anche allinterno di regioni codificanti I microsatelliti sono evidenziabili non solo nel DNA intergenico o dentro gli introni ma esempi ne sono stati riportati anche allinterno di regioni codificanti

20 VANTAGGI Tecnicamente gli STR, a confronto con altri marcatori,presentano il vantaggio di essere: Numerosi Numerosi Equamente distribuiti in tutta la parte eucromatica del genoma Equamente distribuiti in tutta la parte eucromatica del genoma Altamente polimorfici e quindi informativi Altamente polimorfici e quindi informativi Analizzabili facilmente tramite PCR Analizzabili facilmente tramite PCR Questa relativa facilità di studio ha portato ad un rapido incremento del numero degli STRs esaminati Catalogazione standard: es D12S324,dove 12 è il cromosoma sul quale il marker è localizzato e 324 è un codice identificativo( Bennett P: Demystified...Microsatellites. J Clin Pathol:Mol Pathol 2000,53: )

21 ANALISI degli STR Attualmente si utilizzano tecniche di PCR (Polymerase Chain Reaction) I primers, progettati esterni alla sequenza ripetuta ed utilizzati per amplificare le sequenze dei microsatelliti, sono marcati covalentemente con differenti fluorofori Tali molecole assorbono lenergia fornita da un laser per poi riemetterla a lunghezze donda differenti specifiche per ciascun fluoroforo

22 Stutter o Shadow Bands Un problema da affrontare nellanalisi dei microsatelliti è la formazione, durante il processo di amplificazione, di prodotti aspecifici chiamatistutter o shadow bands Un problema da affrontare nellanalisi dei microsatelliti è la formazione, durante il processo di amplificazione, di prodotti aspecifici chiamatistutter o shadow bands La formazione dei prodotti aspecifici è legata alla processività della Taq Polimerasi(Lawyer F. et al.PCR Methods Appl.,1993 May; 2 (4): ) piuttosto che alla struttura secondaria del DNA La formazione dei prodotti aspecifici è legata alla processività della Taq Polimerasi(Lawyer F. et al.PCR Methods Appl.,1993 May; 2 (4): ) piuttosto che alla struttura secondaria del DNA Infatti lutilizzo di una DNA polimerasi termostabile con unalta processività può ridurre notevolmente la formazione di prodotti aspecifici Infatti lutilizzo di una DNA polimerasi termostabile con unalta processività può ridurre notevolmente la formazione di prodotti aspecifici ELETTOFORETOGRAMMA

23 Stutter o Shadow Bands Nel caso delle ripetizioni dinucleotidiche,la stutter band prevalente è di 2 bp più piccola rispetto al picco principale,con in più la formazione di statter bands di 4 e 6bp più piccole anche visibili (Murray V. et al. Nucleic Acids Res,1993,21: ) Nel caso delle ripetizioni dinucleotidiche,la stutter band prevalente è di 2 bp più piccola rispetto al picco principale,con in più la formazione di statter bands di 4 e 6bp più piccole anche visibili (Murray V. et al. Nucleic Acids Res,1993,21: ) Questo comporta che per ciascun allele si abbia un pattern con più bande il che rende complicata linterpretazione dei dati, in modo particolare per campioni di DNA che sono una miscela di due o più individui Questo comporta che per ciascun allele si abbia un pattern con più bande il che rende complicata linterpretazione dei dati, in modo particolare per campioni di DNA che sono una miscela di due o più individui La tendenza, adesso, è di utilizzare marcatori tri- o tetra-nucleotidici che danno risultati più evidenti La tendenza, adesso, è di utilizzare marcatori tri- o tetra-nucleotidici che danno risultati più evidenti

24 Stutter Bands In seguito alla reazione di PCR si osserva la formazione di soltanto una singola stutter band in una posizione di 4bp più piccola rispetto a ciascun allele e lintensità della stutter band è generalmente <10% rispetto al picco principale In seguito alla reazione di PCR si osserva la formazione di soltanto una singola stutter band in una posizione di 4bp più piccola rispetto a ciascun allele e lintensità della stutter band è generalmente <10% rispetto al picco principale Tale percentuale dipende però anche dalla dimensione del picco principale nel senso che,per esempio,per alleli compresi in un range di 166bp, la stutter band è ca il 4% del picco principale ( P.Sean Walsh et al. Nucleic Acids Res,1996,24 (14): ) Tale percentuale dipende però anche dalla dimensione del picco principale nel senso che,per esempio,per alleli compresi in un range di 166bp, la stutter band è ca il 4% del picco principale ( P.Sean Walsh et al. Nucleic Acids Res,1996,24 (14): ) Le statter bands sono anche utili però nellassegnazione manuale dei picchi relativi agli alleli perché la loro presenza serve a discriminare i picchi degli alleli principali rispetto a picchi isolati che sono probabilmente dovuti ad aspecifici Le statter bands sono anche utili però nellassegnazione manuale dei picchi relativi agli alleli perché la loro presenza serve a discriminare i picchi degli alleli principali rispetto a picchi isolati che sono probabilmente dovuti ad aspecifici

25 TRAPIANTO Il trapianto allogenico di midollo osseo (BM) o di cellule staminali periferiche (PBSC) spesso rappresenta il solo approccio terapeutico curativo utilizzabile in diverse malattie neoplastiche e non Il trapianto allogenico di midollo osseo (BM) o di cellule staminali periferiche (PBSC) spesso rappresenta il solo approccio terapeutico curativo utilizzabile in diverse malattie neoplastiche e non Inizialmente il trapianto veniva effettuato soltanto in caso direlated donors, negli utlimi anni viene ampliamente utilizzato il trapianto di BM o di PBSC da HLA-MAtched Unrelated Donors(MUD) Inizialmente il trapianto veniva effettuato soltanto in caso direlated donors, negli utlimi anni viene ampliamente utilizzato il trapianto di BM o di PBSC da HLA-MAtched Unrelated Donors(MUD) Inoltre da quando lacute graft-versus host disease (aGVHD) rappresenta una maggiore complicazione, specialmente in caso di trapianto da PBSC, viene effettuata frequentemente la deplezione delle cellule T del graft Inoltre da quando lacute graft-versus host disease (aGVHD) rappresenta una maggiore complicazione, specialmente in caso di trapianto da PBSC, viene effettuata frequentemente la deplezione delle cellule T del graft

26 TRAPIANTO Molte di queste procedure sono però associate con un sostanziale rischio di incremento di rigetto e di ripresa di malattia, quindi risulta necessario monitorare strettamente il grado di attecchimento del trapianto ( Thiede C. et al. Leukemia,2001,15: ) Molte di queste procedure sono però associate con un sostanziale rischio di incremento di rigetto e di ripresa di malattia, quindi risulta necessario monitorare strettamente il grado di attecchimento del trapianto ( Thiede C. et al. Leukemia,2001,15: ) Diversi approcci sono stati utilizzati a tale scopo ma quello che si è rilevato più utile perché più informativo consiste nellutilizzo di una multiplex PCR mediante la quale è possibile la co-amplificazione in una singola reazione di 9 o più differenti STR e dellamelogenina, che è il locus del sesso Diversi approcci sono stati utilizzati a tale scopo ma quello che si è rilevato più utile perché più informativo consiste nellutilizzo di una multiplex PCR mediante la quale è possibile la co-amplificazione in una singola reazione di 9 o più differenti STR e dellamelogenina, che è il locus del sesso

27 CO-AMPLIFICAZIONE In commercio esistono dei kit che consento di co-amplificare contemporaneamente 10 o più microsatelliti In commercio esistono dei kit che consento di co-amplificare contemporaneamente 10 o più microsatelliti In particolare nel nostro laboratorio viene utilizzato: AmpFlSTR PROFILER dellApplied Biosystems In particolare nel nostro laboratorio viene utilizzato: AmpFlSTR PROFILER dellApplied Biosystems Il kit contiene: Il kit contiene: Buffer Buffer Set di 10 coppie di primers.Un primer di ogni coppia è marcato con un fluorocromo: 5-FAM (5- carbossifluoresceina),JOE e NED che vengono rispettivamente rilevati come blu,verde e giallo Set di 10 coppie di primers.Un primer di ogni coppia è marcato con un fluorocromo: 5-FAM (5- carbossifluoresceina),JOE e NED che vengono rispettivamente rilevati come blu,verde e giallo AmpliTaq Gold AmpliTaq Gold

28 STR system Chromosomes Common Sequence Motif Range (bp) Fluorophores D3S13583pTCTA(TCTG) 1-3 (TCTA) n FAM vWA12p12-pterTCTA(TCTG) 3-4 (TCTA) n FAM FGA4q28 (TTTC) 3 TTTTTTCT(CTTT) n CTCC(TTCC) FAM Amelogenina X: p Y: p11.2 / JOE TH0111p15.5(AATG) n JOE TPOX2p23-2per(AATG) n JOE CSF1PO5q (AGAT) n JOE D5S8185q21-31(AGAT) n NED D13S31713q22-31(GATA) n NED D7S8207q(GATA) n NED Nella seguente tabella sono indicati: il tipo di STR, la localizzazione cromosomica, il core,gli intervalli (range) possibili delle dimensioni in bp dei singoli STR ed il tipo di fluorocromo coniugato ad ognuno di essi

29 cell nucleus chromosome Target Region for PCR Individual nucleotides Double stranded DNA molecule

30 Thermal Cycling Temperatures o C 72oC Time Temperature Single Cycle Typically cycles performed during PCR 95 o C 60 o C 72 o C The denaturation time in the first cycle is lengthened to ~10 minutes when using AmpliTaq Gold to perform a hot-start PCR 95 o C

31 PCR Copies DNA Exponentially through Multiple Thermal Cycles Original DNA target region Thermal cycle

32 In 32 cycles at 100% efficiency, 1.07 billion copies of targeted DNA region are created PCR Copies DNA Exponentially through Multiple Thermal Cycles Thermal cycle

33 ELETTROFORETOGRAMMA

34 Calcolo del chimerismo Per procedere al calcolo del chimerismo, occorre tenere presente che: La valutazione viene effettuata sulla base dei dati rilevati nel ricevente post-trapianto La valutazione viene effettuata sulla base dei dati rilevati nel ricevente post-trapianto Sono da considerarsi solo i loci in cui si osserva chimerismo misto (tra i 10 complessivamente analizzati) Sono da considerarsi solo i loci in cui si osserva chimerismo misto (tra i 10 complessivamente analizzati) Gli alleli condivisi tra donatore e ricevente non sono considerati informativi Gli alleli condivisi tra donatore e ricevente non sono considerati informativi Occorre tenere presente diverse situazioni come di seguito riportato ( Chiede C. et al.Bone Marrow Transplatation,1993,23: ): Occorre tenere presente diverse situazioni come di seguito riportato ( Chiede C. et al.Bone Marrow Transplatation,1993,23: ):

35 Schematic illustration of calculations performed for the quantitative assessment of mixed chimerism I IIIII I.Ricevente e donatore sono omo o eterozigoti e non hanno alleli in comune

36 Esempio: caso I

37 I.Ricevente e donatore sono omo o eterozigoti e non hanno alleli in comune II.Ricevente e donatore sono eterozigoti ed hanno un allele in comune Schematic illustration of calculations performed for the quantitative assessment of mixed chimerism IIIIII

38 Esempio: caso II

39 Schematic illustration of calculations performed for the quantitative assessment of mixed chimerism IIIIII I.Ricevente e donatore sono omo o eterozigoti e non hanno alleli in comune II.Ricevente e donatore sono eterozigoti ed hanno un allele in comune III.Ricevente è omozigote ed il donatore è eterozigote ed hanno un allele in comune

40 Esempio: caso III

41 ALTRA CATEGORIA DI MARCATORI MOLECOLARI

42 SNP (Single Nucleotide Polymorfism) Gli SNPs,scoperti negli anni 80, sono variazioni di sequenza del DNA che si verificano quando è alterato un singolo nucleotide della sequenza genomica Gli SNPs,scoperti negli anni 80, sono variazioni di sequenza del DNA che si verificano quando è alterato un singolo nucleotide della sequenza genomica Affinchè una variazione nella sequenza nucleotidica sia considerata uno SNP, deve essere presente in almeno l1% della popolazione per cui linserzione/delezione di una singola base non deve essere considerata uno SNP Affinchè una variazione nella sequenza nucleotidica sia considerata uno SNP, deve essere presente in almeno l1% della popolazione per cui linserzione/delezione di una singola base non deve essere considerata uno SNP A differenza delle VNTR e degli STRs, gli SNPs non sono sequenze ripetute e possono trovarsi sia nelle regioni codificanti che non-codificanti del genoma ( Dwight H.O.et al.Journal of Molecular Diagnostics, 2000, 2(4): ) A differenza delle VNTR e degli STRs, gli SNPs non sono sequenze ripetute e possono trovarsi sia nelle regioni codificanti che non-codificanti del genoma ( Dwight H.O.et al.Journal of Molecular Diagnostics, 2000, 2(4): )

43 SNP Attualmente sono i marcatori molecolari più utilizzati perché il grande vantaggio nellutilizzarli è dato dallelevato numero di polimorfismi che possono essere genotipizzati e dalla loro elevata densità lungo tutto il genoma Attualmente sono i marcatori molecolari più utilizzati perché il grande vantaggio nellutilizzarli è dato dallelevato numero di polimorfismi che possono essere genotipizzati e dalla loro elevata densità lungo tutto il genoma Costituiscono ca il 90% di tutti i polimorfismi presenti nel genoma umano. A giugno del 2004 nelluomo è stata stimata una frequenza per gli SNP pari a 1/700bp Costituiscono ca il 90% di tutti i polimorfismi presenti nel genoma umano. A giugno del 2004 nelluomo è stata stimata una frequenza per gli SNP pari a 1/700bp Il recente progresso della genomica ha messo in luce come una parte rilevante della variabilità tra individui sia da attribuirsi a polimorfismi a singolo nucleotide Il recente progresso della genomica ha messo in luce come una parte rilevante della variabilità tra individui sia da attribuirsi a polimorfismi a singolo nucleotide

44 SNP Gli SNP acquistano particolare rilevanza in campo biomedico quando possono essere messi in relazione a patologie che non presentano una trasmissione genetica semplice Gli SNP acquistano particolare rilevanza in campo biomedico quando possono essere messi in relazione a patologie che non presentano una trasmissione genetica semplice Confrontando lo schema e le frequenze degli SNP su geni potenzialmente coinvolti in patologie e i fenotipi esibiti dai soggetti portatori, è possibile utilizzare tali sequenze come marcatori molecolari Confrontando lo schema e le frequenze degli SNP su geni potenzialmente coinvolti in patologie e i fenotipi esibiti dai soggetti portatori, è possibile utilizzare tali sequenze come marcatori molecolariPROBLEMI Attualmente sono poco conosciute le distribuzioni degli SNP allinterno di diverse popolazioni Attualmente sono poco conosciute le distribuzioni degli SNP allinterno di diverse popolazioni Non essendo uguali tutti gli SNP,per capire il loro effetto sarà importante eseguire unanalisi computazionale prima di eseguire uno studio relativo al loro eventuale coinvolgimento in una patologia Non essendo uguali tutti gli SNP,per capire il loro effetto sarà importante eseguire unanalisi computazionale prima di eseguire uno studio relativo al loro eventuale coinvolgimento in una patologia

45 Individuazione degli SNP Il più semplice approccio consiste nelleseguire il sequenziamento diretto dei prodotti di PCR di regioni genomiche contenenti il gene di interesse in individui diversi Il più semplice approccio consiste nelleseguire il sequenziamento diretto dei prodotti di PCR di regioni genomiche contenenti il gene di interesse in individui diversi Tale approccio è però molto costoso in quanto richiede lo studio di primers specifici ed inoltre è limitato a regioni di cui è nota la sequenza. Quando si presentano doppi picchi, come negli eterozigoti, non è facile discernere tra artefatti dovuti al sequenziamento e polimorfismi reali Tale approccio è però molto costoso in quanto richiede lo studio di primers specifici ed inoltre è limitato a regioni di cui è nota la sequenza. Quando si presentano doppi picchi, come negli eterozigoti, non è facile discernere tra artefatti dovuti al sequenziamento e polimorfismi reali

46 Individuazione degli SNP Per ottenere un elevato numero di SNP nelluomo, recentemente viene utilizzato un nuovo approccio chiamato Reduced Representation Shotgun Per ottenere un elevato numero di SNP nelluomo, recentemente viene utilizzato un nuovo approccio chiamato Reduced Representation Shotgun Il DNA proveniente da diversi individui viene mischiato e vengono prodotte delle librerie plasmidiche composte da sottoinsiemi di frammenti di restrizione purificati tramite elettroforesi su gel. Viene quindi eseguito un sequenziamento di tipo shotgun su tali librerie e le sequenze che risultano sovrapponibili vengono allineate, mediante limpiego di specifici programmi,andando ad evidenziare i polimorfismi Il DNA proveniente da diversi individui viene mischiato e vengono prodotte delle librerie plasmidiche composte da sottoinsiemi di frammenti di restrizione purificati tramite elettroforesi su gel. Viene quindi eseguito un sequenziamento di tipo shotgun su tali librerie e le sequenze che risultano sovrapponibili vengono allineate, mediante limpiego di specifici programmi,andando ad evidenziare i polimorfismi Genotipizzazione degli SNP mediante microarray...tale metodica dovrebbe ridurre i problemi associati ai segnali aspecifici migliorando la qualità dei risultati ottenuti Genotipizzazione degli SNP mediante microarray...tale metodica dovrebbe ridurre i problemi associati ai segnali aspecifici migliorando la qualità dei risultati ottenuti


Scaricare ppt "ANALISI AUTOMATICA DI MARCATORI GENETICI POLIMORFICI DEL DNA (STR,SNP) E SUE APPLICAZIONI IN CAMPO BIOMEDICO Laboratorio di Oncoematologia Pediatrica (BO)"

Presentazioni simili


Annunci Google