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Claudia Maugeri Gianmarco Motta Grazia Paladino Eliana Pellegrino Prof.ssa Cinzia Di Pietro FACOLTA DI MEDICINA E CHIRURGIA A.C. 2009/2010.

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1 Claudia Maugeri Gianmarco Motta Grazia Paladino Eliana Pellegrino Prof.ssa Cinzia Di Pietro FACOLTA DI MEDICINA E CHIRURGIA A.C. 2009/2010

2 Appartengono alla famiglia dei virus. Sono quindi anchessi parassiti endocellulari obbligati. parassiti endocellulari obbligati

3 Si tratta di aggregati molecolari privi di organelli che ne permettano la replicazione. Dunque se i retrovirus non penetrano in una cellula non riescono a duplicarsi.

4 Esternamente presentano un un involucro fosfolipidico detto capside oenvelope. Allinterno è contenuto il genoma costituito da due molecole di Rna.genoma

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6 Il genoma virale contiene almeno tre geni fondamentali : GAG (group specific antigen), che codifica per le proteine strutturali. POL (polymerase ), che codifica per l enzima Trascrittasi inversa. ENV (envelope), che codifica per le proteine di membrana.

7 Nel genoma virale sono state identificate numerose sequenze che agiscono in cis durante la replicazione virale. Tra queste sequenze vi sono i due LTR (long terminal repeat) situate al 5 e al 3 del genoma del retrovirus, che contengono regioni coinvolte nella trascrizione inversa, nellintegrazione e nella regolazione dellespressione del genoma virale. Tra le altre sequenze disperse allinterno del genoma si trova anche il segnale di impacchettamento (packaging signal) che permette il trasferimento del genoma virale allinterno del virione.

8 Attività della trascrittasi inversa La trascrittasi inversa è un enzima il cui ruolo è quello di trascrivere l'informazione genica da molecola di RNA a molecola di DNA. Sintesi di cDNA L'enzima della trascrittasi inversa, per prima cosa, inizia a trascrivere a partire dal RNA una molecola di DNA complementare nonsense o cDNA. Il punto di avvio è codificato all'interno dell'RNA e prende il nome di promotore costituito da una sequenza di poli-T. L'enzima non possiede l'attività di correzione delle bozze e, pertanto, nel filamento di cDNA si introducono degli errori che determinano la variabilità del virus e la conseguente crisi del sistema immunitario che, ogni volta, si trova di fronte un virus apparentemente sconosciuto.

9 Sintesi di dscDNA La sintesi del cDNA a doppio filamento (dscDNA) avviene sulla base del cDNA precedentemente sintetizzato. L'enzima della trascrittasi inversa se riconosce un solo filamento di ssRNA lo traduce mentre se riconosce lo stesso filamento legato ad una elica di cDNA lo taglia via. Dopo aver liberato la prima elica del cDNA la polimerasi sintetizza l'elica complementare.

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12 Il metodo è costituito da due passaggi: la sintesi di DNA a singolo filamento,utilizzando come stampo lm RNA e la trascrittasi inversa la successiva amplificazione di questo con la reazione di PCR. Lenzima trascrittasi inversa utilizza un oligonucleotide complementare (Primer 1) per iniziare la sintesi di DNA utilizzando una molecola di RNA stampo. Il ssDNA è poi utilizzato come stampo per la sintesi di un singolo filamento di DNA mediante lutilizzo del Primer 2. I Primer 1 e 2 sono poi utilizzati per lamplificazione con la PCR.

13 Sin daglanni 90 inizia lo studio sulle possibili applicazioni delle caratteristiche dei retrovirus Trasformando il virus patogeno in virus helper

14 I primi studi avevano lobiettivo di sfruttare i virus come vettori per veicolare il genoma artificiale allinterno del DNA della cellula ospite. Per modificare il patrimonio genetico di essa correggendone i difetti o conferendole una nuova funzione Terapia a livello embrionale Terapia a livello somatico

15 Creazione in laboratorio del minigene(transgene):contenente promotore, enhancer e tratti esonici e intronici Eliminazione del genoma virale Inserimento del minigene allinterno del virus epurato Inserimento del virushelperallinterno della cellula da trattare

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17 Cura di malattie genetiche ereditarie monogeniche Cura dei tumori Cura di malattie virali (AIDS) Cura di malattie non monogeniche (diabete, sclerosi multipla, distrofia muscolare) Patologie neurodegenerative come lAlzheimer e Parkinson

18 Una volta dentro la cellula bersaglio il transgene viene duplicato dalla trascrittasi inversa(transgene ad RNA) Trascritto direttamente(transgene a DNA) Produzione delle proteine funzionali

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20 Il transgene inserito nel genoma delle cellule tumorali ha lo scopo di silenziare i processi anomali. Possedendo una maggiore capacità trascrizionale Agendo attraverso regolazione post- trascrizionale

21 Primi tentativi del 1993 Inserimento di vettori virali nelle cellule infette dove i minigeni possiedono unattività trascrizionale maggiore rispetto al gene difettoso e tratti nucleotidici che agiscono da silencer

22 Transgene codifica per proteine di membrana le quali costituiranno dei nuovi recettori che non legheranno le proteine di membrana del virus Terapia piuttosto fallimentare perché lHIV è mutageno

23 Il transgene produrrà trascritti in grado di formareproteine che legandosi al genoma virale bloccano la sua attività infettiva

24 Il vettore deve essere riconosciuto e non attaccato dal sistema immunitario Le cellule bersaglio nel caso dei tumori dovrebbero essereinfettateuna per una. Nel caso delle malattie geniche è difficile agire in maniera mirata perché ancora oggi non si conoscono tutte le connessioni intra e inter- molecolari(network)


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