La colonna Colonne GC Capillari Impaccate

Presentazione sul tema: "La colonna Colonne GC Capillari Impaccate"— Transcript della presentazione:

1 La colonna Colonne GC Capillari Impaccate
Wall-Coated Open Tubular Columns (WCOT) Porous-Layer Open Tubular Columns (PLOT) Colonne impaccate: Supporto: - particelle SiO2 (sottile, uniforme) - terra di diatomee Diametro: 2-4 mm Lunghezza: 1.5 – 10 m Colonne capillari : Colonne silice fusa (SiO2) Supporto:polimero poroso, setaccio molecolare, carbonati Diametro: 0.2 – 0.5 mm Lunghezza: 15 – 150 m Polare: (es.: Carbowax 20M) OH(CH2CH2O)nH Tmax = 2500 C; trattiene composti polari, es alcoli Non-polare: (es.: squalano, C30H32) Tmax = 1000 C; Trattiene composti non polari, es idrocarburi

2 SiCl4+2H2O SiO2+4HCl Colonne capillari-1 La silice fusa
Rappresentazione della silice fusa Fasi nella produzione della silice fusa Prelavaggio della preforma con HF diluito e quindi con acqua Estrusione ad alta temperatura (2000 °C) di un tubo capillare da uno stampo in cui il capillare riceve un rivestimento esterno protettivo. Un controllo con laser IR permettono il controllo dell’uniformità dei diametri interni ed esterni del capillare. Disattivazione della superficie interna della colonna Deposizione della fase stazionaria dello spessore desiderato sulla superficie disattivata Rivestimenti protettivi esterni della silice fusa Poliimmide: la piu comune fino a 400 °C Alluminio: per T>400°C Acciaio: la silice è depositata all’interno di un capillare di acciaio

3 Colonne capillari-2 Per ottimizzare le prestazioni della colonna il capillare di silice fusa deve ricevere un pretrattamento prima della deposizione della fase stazionaria allo scopo di Disattivare i siti attivi superficiali Creare una superficie più “bagnabile” per la fase Gruppi silanolo presenti sulla silice Siti di adsorbimento: Forte Debole Forte I silanoli vicinali sono deboli, ma possono essere resi attivi in presenza di acqua Agenti usati per la disattivazione : polisilossani, polietilenglicoli (carbowax) Dopo disattivazione Esempio di attività di una colonna di silice fusa non ricoperta ed effetto della disattivazione con Carbowax 20M

4 Strato poroso integrato
Colonne capillari-3 WCOT La fase stazionaria è depositata come film liquido all’interno del tubo capillare. La fase stazionaria è legata covalentemente alla fase stazionaria  aumento della stabilità e durata Tra le più utilizzate PLOT La fase stazionaria è deposta su un adsorbente o un polimero poroso. Strato poroso (Porous layer): particelle (es.: Al2O3, setacci molecolari) o uno strato composto di adsorbenti. Multistrato – una combinazione di liquidi e materiali adsorbenti  fasi altamente selettive e polari. Bonded PLOT columns: fase stazionaria legata al supporto PLOT PLOT Legata Rivestimento poliimmide particelle 1-2 mm Silice fusa Strato poroso integrato

5 Metodo 2 : legame covalente
Colonne capillari-4 Immobilizzazione della fase stazionaria Il film è stabilizzato e non viene distrutto ad alte temperature di esercizio della colonna Metodo 1 : cross linking Si basa sulla formazione di ramificazioni con aumento del peso molecolare e formazione di una rete tridimensionale. Si ha un aumento della viscosità, rigidità, stabilità. Es. cross linking del dimetilsilossano mediante reazioni radicaliche R. o radiazione g: iniziatori radicalici Metodo 2 : legame covalente La colonna è ricoperta con un polisilossano avente gruppi OH terminali e la temperatura innalzata in modo da ottenere una condensazione tra i gruppi silanolo della superficie della silice fusa e quelli della fase. In tal modo la disattivazione e la ricopertura vengono effettuati contemporaneamente. Si ottiene la formazione di legami Si-O-Si più stabili termicamente dei legami Si-C-C-Si creati con il cross-linking

6 Confronto colonne capillari e impaccate
Olio di menta piperita Colonna impaccata 1 m x 4 mm Colonna capillare 50 m x 0.25 mm Colonna impaccata capillare Lunghezza (m) 1 - 5 60 Diametro interno (mm) 2 4 0.10 0.53 Piatti per metro 1000 5000 Piatti totali 300,000 Risoluzio ne Bassa Alta Stima del flusso (mL/min) 10 0.5 15 Permeabilità (10 7 cm ) Capacità m g/picco <100 ng/picco Spessore del film liquido ( m) 0.1 In definitiva le colonne capillari offrono rispetto alle colonne impaccate : Maggiore velocità di analisi Maggiore efficienza Maggiore inerzia Vita media più lunga Minori perdite di fase Più elevata riproducibilità Minore capacità di caricamento

7 Polietilenglicoli, PEG
Tipi di fasi stazionarie-1 Polimeri siliconici Sono le fasi stazionarie più comunemente usate Presentano: Buona flessibilità dello scheletro (alte velocità diffusione del soluto all’interno del polimero); Ottima stabilità termica Buona capacità di formare films Resistenza alle ossidazioni Metilsilossano Difenildimetilsilossano Cianopropilfenildimetilsilossano Polietilenglicoli, PEG Moderatamente polari I polimeri : Presentano temperatura massima di esercizio limitata (maggiore per i polimeri con legami incrociati) Sono danneggiati facilmente dall’umidità e dall’ossigeno.

8 Fasi stazionarie per GSC
Tipi di fasi stazionarie-2 Maggiore stabilità termica rispetto ai polimeri silossanici Fino a 480 °C carborano Fasi stazionarie per GSC Setacci molecolari (separazione di gas) Allumina (idrocarburi isomeri fino a C6) Copolimeri stirene-divinilbenzene

9 Interazioni del soluto con fase stazionaria
Interazioni dispersive: sono il risultato delle forze di van der Waals e sono deboli e non specifiche. La separazione avviene semplicemente per differenze nel punto di ebollizione. Interazioni dipolo-dipolo: hanno luogo se la molecola di soluto e la fase stazionaria hanno un dipolo permanente. Interazioni dipolo-dipolo indotto: hanno luogo quando un dipolo in una molecola di soluto induce un dipolo transiente nella fase stazionaria che normalmente contiene sistemi aromatici. Interazioni acido-base: le coppie di elettroni di eteroatomi della fase possono agire da basi (es. ossigeno del polietilenglicole, azoto del cianosilossano). Separazioni basate sulla struttura 3D del soluto: le proprietà di chiralità del soluto possono essere usate per la separazione impiegando fasi stazionarie con ciclodestrine.

10 Colonna inerte non degradata
Alcuni problemi nell’analisi GC 1. Interazioni del campione con la fase stazionaria Possono essere di tre tipi : Adsorbimento reversibile  picchi con area totale corretta , ma codati Adsorbimento irreversibile  picchi di forma perfetta, ma parte del soluto rimane adsorbito sui siti attivi della fase Alterazione della fase  sui siti dove gli analiti per interazione con i siti attivi o instabilità termica subiscono degradazione Colonna inerte non degradata Colonna attiva con adsorbimento L’attività di una colonna può dipendere: Contaminazione con il campione Contaminazione con il gas di trasporto Temperatura di esercizio alta Danni alla testa della colonna dovuta a tecniche di iniezione

11 Gli ioni a m/z 207 e 281 sono frammenti silossanici ciclici
2. Perdite di fase stazionaria (Bleed) Possono derivare dalla degradazione della fase stazionaria con eluizione dalla colonna dei frammenti più volatili del polimero. La sensibilità dell’analisi è limitata La linea di base è instabile o crescente Il rivelatore è contaminato Uno spettrometro di massa interfacciato ha sensibilità ridotta Spettro di massa di una perdita di una colonna polisilossanica Gli ioni a m/z 207 e 281 sono frammenti silossanici ciclici

12 Scelta della colonna Devono essere considerati nell’ordine: La fase stazionaria Il diametro interno Lo spessore della fase stazionaria La lunghezza

13 Esempi: 1. La fase stazionaria
E’ di gran lunga il più potente strumento per l’ottimizzazione dell’analisi Polarità crescente 100% Polidimetilsilossano, 50% Polidimetilsilossano 50% phenyl Polietilenglicole Cianopropilsilossano 100% Si preferisce usare fasi stazionarie non polari: Sopportano temperature di esercizio più elevate Hanno maggiore durata 5%fenil-95%metilpolisilossano Esempi: Polidimetilsilossano

14 5% fenildimetilsilossano 7% cianopropil -7% fenilmetilsilossano
L’ottimizzazione della fase stazionaria può consentire una riduzione significativa dei tempi di analisi 7% cianopropil -7% fenilmetilsilossano

15 Scelta della colonna 5 2. Il diametro interno 0.53 mm:
L’efficienza di una colonna è inversamente proporzionale al diametro interno. La capacità di caricamento è direttamente proporzionale al diametro interno Diametri interni piccoli assicurano alta sensibilità poiché i picchi sono più stretti e la risposta del rivelatore è maggiore 0.53 mm: Flusso carrier da 2 a 30 mL/min Facilità realizzare connessioni iniettore-colonna e colonna-rivelatore mm: Le più utilizzate Iniezione split/splitless mm: Danno la massima risoluzione possibile Connessione con il sistema di iniezione molto delicata 0.53 mm 0.25 mm Scelta della colonna 5

16 3. Lo spessore della fase stazionaria
Capacità di carico Ritenzione Efficienza Film sottili per composti altobollenti Film più spessi per composti bassobollenti

17 4. La lunghezza La risoluzione R dipende dalla radice quadrata dell’efficienza (N) e quindi della lunghezza della colonna. Raddoppiando la lunghezza si ha un aumento della risoluzione di solo il 40% Aumentare la lunghezza comporta diversi svantaggi : Raddoppio del tempo di analisi Raddoppio delle perdite di fase dalla colonna Diminuzione dell’inerzia chimica della colonna dovuto al maggior tempo di interazione del campione con i siti attivi. Analisi in isoterma 30 m 60 m

18 L’equazione di van Deemter
Parametri che influenzano l’efficienza della separazione cromatografica 1. La velocità del flusso del carrier L’equazione di van Deemter H= altezza equivalente del piatto teorico A= diffusione di Eddy o termine legato ai cammini multipli della colonna B= contributo della diffusione longitudinale C= resistenza al trasferimento di massa nella fase mobile e stazionaria u = velocità di flusso del gas. A= 2ldp l : Uniformità impaccamento; dp :diametro particelle Per una colonna capillare diventa Equazione di Golay

19 Efficienza più alta, ma velocità più bassa
CM r2/Dg (r = raggio colonna capillare) oppure dp2/Dg (colonna impaccata) Dg= coeff. diffusione soluto nel gas CS df2/Ds df spessore film liquido; Ds coefficiente diffusione del soluto nel liquido Efficienza più alta, ma velocità più bassa La velocità ottimale del flusso di gas è nell’ordine H2>>He>>N2>Ar

20 2. L’effetto della temperatura
T basse T alte Gradiente temperature Analiti con punti di ebollizione molto differenti possono essere separati variando la temperatura nel corso dell’analisi

21 Scelta del gradiente di temperatura
Temperatura troppo alta: i composti più ritenuti danno picchi stretti, i composti meno ritenuti non sono separati. Analisi in gradiente di temperatura: picchi stretti e tempi di analisi ridotti . Temperatura troppo bassa : i composti meno ritenuti sono separati, i più ritenuti danno picchi slargati. Scelta del gradiente di temperatura

22 3. Il rapporto di fase 0.25 mm, 0.25 mm 0.5 mm, 0. 50 mm
r = raggio della colonna df= spessore film fase stazionaria Valori comuni del rapporto di fase Mantenendo costante il rapporto di fase i tempi di ritenzione e l’ordine di eluizione rimangono invariati 0.25 mm, 0.25 mm 0.5 mm, mm

23 Derivatizzazione degli analiti
Vantaggi Aumenta la volatilità e diminuisce la polarità dei composti. Stabilizza composti che sono instabili alle temperature richieste per la GC. Migliora la separazione di gruppi di composti in GC. Fornisce informazioni sul numero ed il tipo di funzionalità presenti in miscele di composti incogniti. Migliora la risposta dei composti a rivelatori selettivi per es. quelli a cattura elettronica, o spettrometri di massa. Svantaggi I reagenti usati per la derivatizzazione possono essere difficili da rimuovere ed interferire con l’analisi Le condizioni di derivatizzazione possono produrre trasformazioni chimiche indesiderate in un composto per es. la disidratazione La reazione utilizzata deve essere quantitativa Si possono compensare perdite di materiale usando uno standard interno

24 Principali tipi di derivatizzazione
1. Sililazione Reattivi: trimetilsililcloruro (TMSCl); N,O-bis(trimetilsilil)acetammide (BSA), N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetammide (BSTFA) (dà derivati più volatili) 2. Acilazione Reattivi: Anidride acetica; acetilcloruro; anidride trifluoroacetica (TFAA);Anidride pentafluoropropionica (PFPA); anidride eptafluorobutirrica (HFBA); pentafluoropropionil cloruro (PFBCl); Eptafluorobutirrilcloruro (HFBCl)

25 3. Alchilazione 4. Condensazioni Reattivi: metanolo/ BF3 ; CH2N2;
Metilsulfinilcarbanione (DMSO/NaH)/metilioduro; Pentafluorobenzilbromuro (per ECD) 4. Condensazioni Es. formazione di ossime Reattivi: Idrossilammina.HCl Pentafluorobenzilidrossilammina (PFBO)

26 L’indice di Kovatz-1 Metodo 1:
Permette di usare e confrontare dati GC ottenuti in condizioni diverse L’indice di ritenzione di Kovats (I o RI) indica dove eluisce un analita rispetto ad un alcano a catena lineare. Ad un n-alcano viene assegnato un indice di ritenzione pari a 100 volte il numero di atomi di carbonio. RI per un normal alcano = # carbon atoms x 100 Es n-ottano RI = 800 n-dodecano  RI = 1200 Tali valori sono identici per definizione in qualunque sistema cromatografico Per determinare il valore di RI per un analita si possono usare due approcci: Metodo 1: Effettuare l’analisi GC in presenza di una miscela di n-alcani. Riportare il log dei tempi di ritenzione contro RI per gli alcani Il valore di RI per l’analita di interesse viene estrapolato Esempio : acetato di isoamile. Può essere definita la selettività di una particolare fase stazionaria comparando i valori di RI di un soluto in una fase non polare come lo squalano o OV-101 (RI=872 per l’acetato di isoamile) con quello in una fase più polare come Carbowax 20M (RI=1128). Cosi ad esempio l’acetato di isoamile eluisce tra n-C11 e n-C12 sulla Carbowax 20M ma dopo il n-C8 sulla OV-101

27 L’indice di Kovatz-2 Metodo 2:
In condizioni isoterme il valore di RI per un analita può essere calcolato dall’espressione: Dove: Tempo di ritenzione dell’analita di interesse Tempo di ritenzione del n-alcano che eluisce prima dell’analita Tempo di ritenzione del n-alcano che eluisce subito dopo l’analita Numero di carboni del n-alcano avente tempo di ritenzione Nel caso si usi un gradiente di temperatura i valori dei tempi di ritenzione sono sostituiti nell’equazione con le temperature di eluizione in K. Il secondo metodo dà una stima del valori di RI più accurata del metodo grafico

28 Metodi per l’ analisi quantitativa
Analisi quantitative molto accurate di metaboliti complessi, farmaci, tossine etc in fluidi biologici possono essere ottenute mediante spettrometria di massa con il METODO DELLA DILUIZIONE CON ISOTOPI STABILI Come si effettua: 1.Si sintetizza l’analita marcato con uno o più isotopi più pesanti o più leggeri dello stesso elemento. 2. Si aggiungono quantità identiche della specie marcata isotopicamente al campione ed allo standard. 3. Si effettua l’analisi GC-MS. Misurare nello spettro di massa l’area del picco di uno ione frammento ottenuto dall’analita e dalla forma marcata isotopicamente. Questi si presenteranno nello spettro come picchi separati perché differiscono per massa. Si usano composti marcati con D e/o 13C che presentino una differenza di massa di almeno 3 u.m.a. rispetto all’analita. Il rapporto area analita/area dell’isotopo è proporzionale alla massa dell’analita Calibrando il rapporto delle aree vs la massa nello standard è possibile valutare la massa dell’analita nel campione

29 Raffinazione del petrolio
GC-applicazioni Raffinazione del petrolio 0.03°C/min 12°C/min Miscele molto complesse ( alcani lineari/ramificati, alcheni) E’ necessario sviluppare condizioni cromatografiche opportune(gradiente di temperatura, uso di più rivelatori )

30 Raffinazione/analisi del petrolio
GC-applicazioni Raffinazione/analisi del petrolio Impiego di diversi rivelatori FID TCD Refinery Gas Analysis, FID Output 1. C3/C6+ composite n-Butane 2. Methane Butene 3. Ethane/Ethylene Isobutylene 4. Propane t-2-Butene 5 Acetylene c-2-Butene Propylene ,3-Butadiene 7. Cyclopropane Isopentane 8. Isobutane n-Pentane 9. Propadiene Refinery Gas Analysis, TCD Output 1. Hydrogen 2. Carbon Dioxide 3. Ethlyene Ethane Acetylene Hydrogen Sulfide 7. Oxygen Nitrogen Methane Carbon monoxide

31 Analisi cliniche/forensiche
GC-applicazioni Analisi cliniche/forensiche Determinazione etanolo in fluidi biologici Iniezione dei componenti volatili in equilibrio con un campione di sangue Analisi su spazio di testa di fiale incubate ad una data temperatura. Colonna 1.80 m impaccata con Carbowax 20M su Carbopack B 60/80 Forno: 75°C; iniettore: 150 °C; rivelatore: 200 °C.

32 Analisi di pentano nel fiato
GC-applicazioni Analisi cliniche Composti volatili per la diagnosi di patologie Standard controllo Analisi di pentano nel fiato Esempio di GSC Colonna impaccata con Porasil tenuta a 60°C, rivelatore FID

33 TIC di un estratto di urina
GC-applicazioni Analisi cliniche/forensiche Screening di droghe da abuso Si effettua mediante una combinazione di metodi immunologici e cromatografici GC, TLC e HPLC. Il test di conferma è effettuato mediante GC/MS. FID NPD 1. Methamphetamine 2. Caffeine 3. Phencyclidine 4. Methadone Cocaine Codeine 7. Diazepam 8. Heroin TIC di un estratto di urina

34 Analisi cliniche/forensiche
GC-applicazioni Analisi cliniche/forensiche Steroidi anabolizzanti 5-Androstene-3b,17b-diol 17a-Methyl-5-androstene 3b,17b-diol 5a-Androstan-17b-ol-3-one 19-Nortestosterone 17a-Methylandrostan-17b-ol-3-one Mesterolone Testosterone 17a-Methyltestosterone 1-Dehydrotestosterone 1-Dehydro- 17a-Methyltestosterone Bolasterone Oxymethalone 19-Nortestosterone-17-propionate Testosterone propionate Fluoxymesterone 4-Chlorotestosterone-17-acetate Testosterone-17b-cypionate 1-Dehydrotestosterone benzoate 2-Dehydrotestosterone undecylenate Rivelatore FID colonna 5%fenilmetilsilossano 30 m, i.d mm, film 0.10 mM

35 Analisi ambientali Metodi EPA GC-applicazioni Method EPA Method 8151
Analisi di suoli/acque Metodi EPA Method EPA Method 8151 Title CHLORINATED HERBICIDES BY GC USING METHYLATION OR PENTAFLUOROBENZYLATION DERIVATIZATION:CAPILLARY COLUMN TECHNIQUE Abstract Water samples are extracted with diethyl ether and then esterified with either diazomethane or pentafluorobenzyl bromide. Soil and waste samples are extracted and esterified with either diazomethane or pentafluorobenzyl bromide. The derivatives are then analyzed by GC/ECD (gas chromatograph with electron capture detector). Campione : terreno (1 g) Rivelatore : ECD Temp Rivelatore : 320 °C Colonna: VB-5, 30mx0.25 mmx0.25 mm Temp Colonna: 60°C per 2 min a 180 °C a 20°C/min a 220 °C a 4°C/min a 300 °C a 40°C/min (5 min) Temp Iniettore: 200 °C Split ratio : 1:15