(2012/2013) LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGICHE DEL FARMACO INSEGNAMENTO DI UNIVERSITA’ DEGLI STUDI NAPOLI FEDERICO II Titolare Dr. Roberto Russo

Presentazione sul tema: "(2012/2013) LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGICHE DEL FARMACO INSEGNAMENTO DI UNIVERSITA’ DEGLI STUDI NAPOLI FEDERICO II Titolare Dr. Roberto Russo"— Transcript della presentazione:

1 (2012/2013) LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGICHE DEL FARMACO INSEGNAMENTO DI UNIVERSITA’ DEGLI STUDI NAPOLI FEDERICO II Titolare Dr. Roberto Russo roberto.russo@unina.it FARMACOLOGIA APPLICATA

2 Le funzioni principali della respirazione consistono nel fornire O 2 all’organismo e nel rimuovere la CO 2 Alla regolazione automatica del respiro, controllata dai centri respiratori al livello centrale, si sovrappone un moderato controllo volontario regolato dalla corteccia celebrale Nel normale controllo neuroumorale delle vie respiratorie le vie efferenti sono costituite: sistema parasimpatico (acetilcolina) sistema simpatico (adrenalina e noradrenalina) sistema NANC (NO, neuropeptidi eccitatori)

3 Le vie afferenti sono costituite da tre tipi di recettori sensoriali quali: recettori di tensione ad adattamento lento fibre sensoriali non mieliniche di tipo C recettori irritanti ad adattamento rapido Stimoli diversi, agendo su tali recettori provocano tosse, broncocostrizione e aumento della produzione di muco Stimoli esogeni: ammoniaca, fumo, capsaicina ecc. Stimoli endogeni: mediatori dell’infiammazione

4 Lo sviluppo dell’asma coinvolge fattori ambientali e genetici L’asma bronchiale è una sindrome caratterizzata da una reversibile e ricorrente ostruzione delle vie aeree Mentre l’attacco asmatico è reversibile (a differenza delle malattie ostruttive), l’alterazione patologia alla base della iperresponsività bronchiale è generalmente irreversibile. L’ipersensibilità bronchiale indica la sensibilità eccessiva che i bronchi presentano verso svariati stimoli quali:irritanti chimici, aria fredda, farmaci, allergeni, inquinanti atmosferici ecc.

5 Fase immediata: viene scatenata bruscamente con spasmi della muscolatura liscia bronchiale. I mediatori coinvolti sono: istamina, leucotrieni (LTC 4, LTB 4, LTD 4 ), neurochinina A, si ha richiamo di eosinofili e cellule mononucleate creando il presupposto per la 2° fase Fase tardiva: Si manifesta dopo un tempo variabile dalla esposizione allo stimolo. Essenzialmente è una reazione infiammatoria, con un coinvolgimento massiccio di cellule Th2 attivate che rilasciano citochine ed eosinofili i cui prodotti danneggiano l’epitelio. Altri mediatori coinvolti in questa fase sono: l’adenosina (recettore A1), l’ossido d’azoto, e i neuropeptidi Schematicamente si può suddividere l’attacco asmatico in 2 fasi:

6 L’istamina è considerata uno dei mediatori maggiormente coinvolti nell’attacco asmatico. Antagonisti del recettore H 1 dell’istamina sono ampiamente utilizzati per il controllo dell’asma. Il saggio di binding per il recettore H 1 permette di valutare potenziali f. che agiscono a questo livello Tale saggio valuta la capacità del f. in esame di spiazzare l’antiH1 triziato [ 3 H]-pirilamina in preparazioni di membrana cellulare ottenute da cervello di cavia Test in vitro

7 PROCEDURA Si preleva rapidamente il cervello di cavia che viene omogenato a freddo in un tampone opportuno Si effettuano una serie di centrifugazioni e sospensioni; il campione ottenuto viene congelato a -80°C. Il pellet è incubato con: - [ 3 H]-pirilamina (total binding) (A) - [ 3 H]-pirilamina + mepiramina (non specific binding) (B) - [ 3 H]-pirilamina + F da testare Il composto marcato viene saggiato a diverse concentrazioni (0.1-50 x 10 -9 M), si lascia incubare per 30 minuti a 25°C sotto agitazione. La reazione viene bloccata. Si aggiunge il liquido di scintillazione e si legge la radioattività con il  counter

8 Valutazione dei risultati Specific binding= total binding (A) – non specific binding (B) % di inibizione = A-B/A x 100 Con tale procedura si può risalire al valore della costante di dissociazione (Ki) e del IC50 del farmaco.

9 POLMONE ISOLATO E PERFUSO SCOPO Il polmone isolato e perfuso di ratto permette la simultanea registrazione dell’attività dei vasi polmonari e delle risposte delle vie aeree a vari farmaci. PROCEDURA Maschi Sprague-Dawley di peso 300-350 g sono anestetizzati. La trachea è incannulata con un tubo in polietilene, collegato ad un ventilatore ed una camera d’aria arricchita con Ossigeno e CO2 al fine di mantenere una adeguata pressione respiratoria pressione. I ratti sono trattati con 1.000 unità di eparina endovenosa e sono rapidamente dissanguati (prelievo dalla carotide). Il polmone è esposta da sternotomia, ed una legatura è fatta attorno alla aorta per prevenire perdita di sangue. I polmoni sono perfusi con una pompa peristaltica ad una portata di 8-14 ml / min. La Pressione arteriosa polmonare, e l’attività contrattile delle vie aeree sono elettronicamente monitorati e registrati con un poligrafo. VALUTAZIONE Modifiche (aumentare o diminuire) in arteriosa polmonare pressione e pressione nelle vie aeree dopo l'iniezione di prova composti sono misurati in mm Hg e rispetto con la linea base Test ex vivo

10 Induzione del broncospasmo nella cavia Misura del volume di aria respirata in un animale in cui la ventilazione è regolata artificialmente da un sistema chiuso. L’apparecchio consiste in una pompa di respirazione che è connessa alla trachea mediante una cannula in cui è possibile definire il volume d’aria immesso nell’animale ed il volume in eccesso. Quando la cavia va in broncospasmo il volume d’aria inspirata si riduce mentre quello dell’aria in eccesso aumenta per cui, misurando la variazione del volume di aria in eccesso, si può risalire al grado di broncospasmo Test in vivo

11 Procedura Cavie (300-500 g) sono anestetizzate con uretano i.p. o con pentobarbital + pancuronio s.c. (in entrambi i casi è necessario ottenere l’inibizione della respirazione spontanea poiché l’animale deve ricevere aria esclusivamente dalla pompa di ventilazione). La trachea viene cannulata con un tubicino a due vie: uno è connesso alla pompa di ventilazione, l’altro (che convoglia l’aria in eccesso) ad un sistema di rivelazione. Il volume e la frequenza di aria insufflata viene valutato a seconda del peso dell’animale La giugulare e la carotide sono isolate e incannulate per la somministrazione i.v. e per il monitoraggio della pressione arteriosa

12 Come agenti broncocostrittori si usano: acetilcolina (20-40 µg/kg) atropina istamina (5-20 µg/kg) tolpropamina bradichinina (10-20 µg/kg) aminofillina ovalbumina (1 mg/kg) PAF (25-50 ng/kg) Sostanza P (0.5 µg/kg) Dopo aver ottenuto 2 broncospasmi di uguale intensità il f. da testare viene somministrato Quindi si ripete la somministrazione del broncocostrittore e si valuta l’eventuale riduzione del broncospasmo

13 Valutazione dei risultati I dati vengono calcolati come % di inibizione del broncospasmo prima e dopo il farmaco in esame

14 Valutazione dell’iperreattività bronchiale nella cavia L’inalazione di istamina (o di altri agenti broncocostrittori) per aerosol nella cavia induce spasmi asfittici simili all’attacco asmatico nell’uomo. La sintomatologia prevede: aumento della frequenza respiratoria, respirazione affannosa, convulsioni asfittiche F. potenzialmente attivi contro tale iperreattività possono ritardare e limitare i sintomi

15 Procedura Sono utilizzati gruppi di 10 cavie (300-400 g) per trattamento. La gabbia per l’inalazione è costituita da due aree (A e C) connesse da un passaggio (B). Nell’area A viene nebulizzato il f. da testare (controllo o cont.+) per 1 minuto Alternativamente il f. può essere somministrato per via orale o s.c. a tempi stabiliti prima dell’esposizione all’agente spasmogeno. Nell’area C viene nebulizzato una soluzione allo 0.1% di istamina. Quando si manifestano le convulsioni asfittiche l’animale viene allontanato dalla gabbia.

16 Valutazione dei risultati il tempo necessario affinché si manifestino le convulsioni (tempo di pre-convulsione) viene confrontato tra i vari gruppi

17 Attività antitussive dopo l'inalazione di agente irritante (cavie, ratti, topi) SCOPO Tosse è causata da un riflesso; i recettori localizzati nell'albero bronchiale, possono essere stimolati meccanicamente o chimicamente, ad esempio, per inalazione di sostanze irritanti. Tra le sostanze più irritanti abbiamo l’acido citrico nella cavia. PROCEDURA Sono utilizzate cavie di entrambi i sessi di peso 300-400 g. L'animale viene posto in un recipiente di vetro cilindrico, con 2 tubi alle due estremità. Uno funge da ingresso dell'aerosol, l'altro per il suo efflusso. Quest'ultimo tubo ha un braccio laterale è chiuso con un pinch-clamp, che permette la regolazione dei cambiamenti d’aria. La cavia è esposta ad aerosol di 7,5% di acido citrico in acqua per 10 min. Ciascun animale è testato prima per ottenere una valore basale, si aspetta almeno un'ora per la seconda esposizione. dopo 30 min dalla somministrazione della sostanza (S.C. o per via orale) la cavia è sottoposto nuovamente alla aerosol. Anche in questo caso si valuta il numero di tosse durante 10 min viene registrato. VALUTAZIONE Il numero di tosse dopo il trattamento viene generalmente espresso come percentuale. Utilizzando varie dosi si può calcolare il valori di ED50. VARIAZIONI Agenti irritanti: Capseicina, ammoniaca,

18 Studi sulla secrezione di muco (furetti, ratti, cani) Ex vivo La secrezione del muco è stata nella trachea isolata di furetto o cane. L’esperimento viene effettuato sull’animale anestetizzato/scarificato con trachea isolata; si stimola la secrezione attraverso stimolazione elettrica. Si valuta la quantità di muco prodotto in presenza del f. dopo 45 -90 -130 minut. Vivo Somministrazione (in ratti) di sostanze che aumentano la secrezione di muco e valutazione di questo attraverso la somministrazione di blu di evans (colorante) per via tracheale. L’animale verrà sacrificato a tempi prestabiliti valutando la concentrazione di blu evans utilizzando un lettore di micropiastre in assorbanza (lettura a 450nm)

19 FINE